论文部分内容阅读
龙血竭(Resina Draconis),我国珍稀名贵中药,素有“活血圣药”之称,具有活血散瘀,定痛止血,敛疮生肌的功效。国家药品标准规定其来源为百合科植物剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen的含脂木材经提取得到的树脂,而早在1991年剑叶龙血树就被定为国家二级濒危保护植物,因此,目前我国龙血竭药材的提取原料完全依赖老挝、越南等东南亚国家进口,且随着人们对龙血竭需求量的不断攀升,龙血竭原料资源在国外亦日益匮乏。因多种龙血树属植物在自然条件或人工诱导后均可形成红色树脂,药材收购商常将几种龙血树的含脂木材混在一起销售,更有甚者甚至将龙血树属以外其它科属植物的红色含脂木材也混在龙血竭提取原料中,严重影响了龙血竭的临床用药安全与正常的市场流通。因此,龙血竭药材基原的准确鉴定意义重大,然而,目前关于龙血竭药材基原的分子鉴定研究尚属空白。此外,我国及老挝、越南等东南亚地区分布着一种被国内习称为岩棕D.sp的龙血树属植物,该植物分布较广、数量较多,且可形成红色树脂,常作为龙血竭的提取原料被广泛应用,然而,对其药材品质评价方面的研究未见报道。基于以上情况,本研究首先采用常规DNA条形码片段对龙血树属植物进行鉴定效率评价研究,之后利用叶绿体基因组对龙血竭基原及其同属植物进行super-barcode鉴定研究,在此基础上筛选合适的DNA条形码片段,对龙血竭基原及其同属植物进行专一性barcode研究。其次,本研究比较了岩棕与剑叶龙血树所产龙血竭的主要活性成分含量差异,并采用代谢组学方法比较两种龙血竭及原植物茎部的整体化学组成差异性;最后,通过高通量转录组测序初步分析龙血竭的形成机制。主要研究结果如下:1.常规DNA条形码片段(ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK)对龙血树属植物鉴定效率极低,matk是其中鉴定效率最高的条形码片段,但其鉴定效率仅为42.86%。采用叶绿体基因组作为super-barcode对龙血树属植物进行鉴定研究,结果显示,super-barcode可很好的区分龙血树属植物。在叶绿体基因组测序基础上,对所筛选的4条高变区间片段(trnP-psaJ、psbK-psbI、trnT-trnL和clpP)进行鉴定效率比较研究,结果显示仅clpP片段可对7种龙血树属植物进行准确鉴定,但其片段较长,扩增及测序成功率较低;采用联合序列片段“psbK-psbI+trnP-psaJ”可对龙血树属植物进行准确的分子鉴定,且扩增及测序成功率高,可作为龙血竭基原及龙血树属植物分子鉴定的最佳DNA条形码片段。此外,依据叶绿体基因组及DNA条形码片段所构建的系统进化树,我们认为剑叶龙血树D.cochinchinensis与海南龙血树D.cambodiana不宜合并处理,应单独列种。2.5种主要化学成分(龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀茋、7,4’-二羟基黄酮)中,除龙血素A的其余4种成分在两种龙血竭中含量均有显著性差异。以剑叶龙血树为基原的龙血竭(以下简称正品龙血竭)中白藜芦醇、7-4’-二羟基黄酮含量较高,而岩棕所产龙血竭(以下简称岩棕龙血竭)中龙血素B、紫檀茋含量较高,其中岩棕龙血竭的龙血素B含量明显高于正品龙血竭(9.4倍),因此,岩棕龙血竭有作为正品龙血竭代用品的开发潜力。此外,正品龙血竭的龙血素A含量远远高于龙血素B(26倍),且二者均为龙血竭活血化瘀的主要活性成分,鉴于目前多数正品龙血竭药材的龙血素B含量无法达到国家药品标准规定的最低限量(0.4%),因此,作者建议相关部门在修订龙血竭药品标准时,将龙血素A含量或龙血素A、B含量之和作为龙血竭质量控制的含量指标。3.建立了一种基于超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱联用质谱技术(UPLC-Q-Orbitrap-MS)的代谢组学方法,用于比较岩棕龙血竭与正品龙血竭的化合物组成差异性。OPLS-DA分析结果显示,岩棕龙血竭与正品龙血竭的化合物组成存在明显差异(R2Y=0.999,Q2=0.977)。最终,共鉴定(或临时鉴定)差异化合物154个,其中岩棕龙血竭中含量较高的有93个,正品龙血竭中含量较高的化合物有61个,差异化合物并无明显的类别差异性。归一化峰面积比较分析结果显示,胺类、酚酸类、生物碱类、萜类、有机酸类、甾体类化合物在岩棕龙血竭中含量较高,而苯丙素类、黄酮类化合物在正品龙血竭中含量较高,主要活性成分黄酮类化合物在正品龙血竭中含量较高。最后,我们筛选出8个化合物作为区分岩棕龙血竭与正品龙血竭的差异标志物。4.运用代谢组学方法比较岩棕与剑叶龙血树健康茎部的化学组成差异性。OPLS-DA分析结果显示,两种龙血树健康茎部的化学组成有明显差异(R2Y=0.998,Q2=0.954)。在所分析的所有特征值(feature)中,同时满足VIP>1.0且P<0.01的共有619个,比伤害诱导后的差异化合物(feature)少了 470个,说明岩棕与剑叶龙血树茎部的化学组成在伤害诱导前就存在一定的差异性,而这种差异性在伤害诱导后变的愈发明显。最终,共鉴定(或临时鉴定)化合物79个。归一化峰面积比较分析结果显示,剑叶龙血树健康茎部含有较高的氨基酸、有机酸类化合物,而岩棕的茎部则含有较高的黄酮类、生物碱类、甾体类、胺类化合物。5.对剑叶龙血树伤害诱导后的茎部样品进行转录组测序,组装后的Unigene number为63,244,得到注释的Unigene共有27,912个。差异表达基因统计结果表明,剑叶龙血树伤害诱导后前3d是其胁迫反应的最活跃时期。组间差异表达基因GO term富集及KEGG pathway统计结果显示,在伤害诱导后3d内,植株中多个与生长发育、器官发育、生殖系统发育等相关的生理进程处于下调阶段,而与多种次生代谢产物的生物合成途径、植株光合作用、抗胁迫反应等相关途径进入上调阶段。而在伤害诱导3d后,多种次生代谢产物生物合成途径及抗胁迫反应途径逐渐进入下调阶段。与黄酮类化合物(龙血竭主要活性成分)相关的代谢途径在伤害诱导后的前3d,并没有被差异表达基因显著富集到,而在伤害诱导3d后,多个差异表达基因富集到相关途径。分析结果显示,剑叶龙血树与海南龙血树在龙血竭形成过程的各个阶段,其差异基因数量及所富集的代谢途径存在明显差异,证明其形成机制有所差异。