鸢尾黄素对肝纤维化改善作用的机理研究

• 作 者: 王玉蓉
• 机 构: 南京大学
• 出 处: 南京大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: 鸢尾黄素 肝纤维化 胞外基质 动物模型

肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础，是进一步向肝硬化发展的必经阶段，将肝脏病变终止于肝纤维化阶段或逆转之，是治疗慢性肝病的理想手段。抗肝纤维化治疗需要从控制原发病、抑制肝星状细胞活化和增殖、促进其凋亡、抑制胶原合成、促进胶原降解以及对影响纤维化的细胞因子的调控等多方面入手进行综合治疗。而其中针对肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)的治疗已经成为十分重要的肝纤维化治疗策略。　　
鸢尾属(Iris)植物被广泛地作为民间传统中药，该属植物中存在大量异黄酮类化合物，其中鸢尾黄素为其主要成分，具有抗氧化、保肝、抗癌等多种生物活性和药理作用。本课题组前期研究发现鸢尾黄素对实验性大鼠肝纤维化具有显著的治疗作用，具有开发成治疗肝纤维化药物的潜力。　　
为了探讨鸢尾黄素对肝纤维化改善作用可能的作用机理，本实验以肝星状细胞HSC-T6细胞株为体外模型，研究了鸢尾黄素对HSC-T6的增殖抑制和促凋亡作用，并初步探讨了其促肝星状细胞凋亡的机制以及对胞外基质合成和降解的影响。本实验主要运用MTT法检测了鸢尾黄素对HSC-T6、L02细胞活性的影响；Brdu标记法检测鸢尾黄素对HSC-T6细胞增殖的影响；Hochest33342荧光染色观察鸢尾黄素处理后HSC-T6细胞形态的变化；Annexin V/PI双染流式细胞术对细胞凋亡定量分析；荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平变化；荧光染料Fura2-AM检测细胞内Ca2+浓度变化；荧光染料罗丹明123检测细胞线粒体膜电位变化；Western blotting检测细胞色素C和caspase-9的表达变化；分光光度法检测caspase-3活性以及Real time PCR法检测α-SMA、Ⅰ型胶原、MMP-1以及TIMP-1mRNA的表达变化。　　
结果表明：鸢尾黄素能有效抑制HSC-T6细胞增殖，且有剂量、时间依赖关系而对正常人肝细胞L02抑制率在30％以内，即其抑制作用有一定的选择性；鸢尾黄素处理后，细胞呈明显凋亡形态，有凋亡小体、核质碎片和圆缩出现；而且通过AV/PI双染实验定量分析了鸢尾黄素处理后的肝星状细胞的凋亡率显著增加，呈剂量时间依赖关系，这一结果与后面的PI细胞周期实验检测的结果一致；在肝星状细胞凋亡机制的研究中，我们发现：ROS的水平随鸢尾黄素浓度的升高而升高，细胞内游离Ca2+浓度呈快速、持续升高；细胞线粒体膜电位呈显著下降的趋势；肝星状细胞胞浆中细胞色素C和激活的caspase-9，-3的含量增加；在鸢尾黄素对胞外基质影响的研究中，我们发现：鸢尾黄素显著抑制肝星状细胞中Ⅰ型胶原及活化标志α-SMA mRNA的表达以及促使LX-2细胞中MMP-1mRNA的表达升高而降低TIMP-1mRNA的表达。　　
因此我们可以推测出以下结论：1)、鸢尾黄素能有效抑制HSC-T6细胞增殖，且毒副作用较小。它能诱导细胞凋亡，发挥体外抗肝纤维化作用；2)、鸢尾黄素处理HSC-T6细胞后，由于应激反应，短时间内出现ROS水平升高，同时刺激细胞Ca2+内流，使线粒体通透性增加，导致线粒体△Ψmt下降，释放细胞色素C，激活caspase级联反应，使DNA断裂，产生凋亡小体，导致细胞凋亡出现；3)、鸢尾黄素一方面通过抑制肝星状细胞的持续活化，进而减少HSC合成分泌Ⅰ型胶原，从而减少细胞外基质的沉积；另一方面鸢尾黄素通过促进活化的HSC中MMP-1的表达，从而促进细胞外基质的降解，同时鸢尾黄素通过下调活化的HSC中TIMP-1 mRNA表达，降低其对MMPs的抑制作用，进一步促进ECM的降解，从而达到减轻肝纤维化的作用。