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研究目的：HBV呈全球化的流行趋势,全球大约有3.5亿HBV携带者,而我国就有接近1亿的乙肝携带人群。此外我国每年的新近HBV感染患者约10万人,因此HBV是严重危害我国人民生命健康的严重传染性疾病。在这其中除了HBV导致的慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌外,HBV导致的肾损害也较普遍。根据不完全的资料统计数据,肾脏损害的发生率可高达20%,因此,HBV-GN也是我国主要的继发性肾脏病变之一。HBV的复制可导致肝脏病变的进展,在许多临床研究中已经得到证实。如在HBV复制与HCC的发生关系研究方面,随着病毒复制的增加,HCC的发生率明显上升,具有统计学的差别。例如研究发现,血清中病毒水平为105copies/ml与HBV阴性对比,发生HCC的危险性为6.6；在HCC的生存预后的研究中发现,HBV复制水平是影响HCC的独立危险因素。因此,HBV复制与肝脏病变进展密切相关。除肝脏受累外,肾脏是HBV感染的另一重要器官。虽然以往的研究认为,肾脏病变的发生主要机制为HBV抗原复合物介导的免疫反应,与病毒复制之间的关系并为明确,但从理论分析,随着复制的增多,相应的血中循环病毒量释放增多,形成循环免疫符合物的几率也是增多的；其次,病毒本身可侵害肾组织,病毒量的增加也可导致病变的加重。因此我们的研究目的之一是进一步探讨HBV复制对HBV-GN发病机制的影响以及疾病进展的相关性,是否存在类似肝脏病变的相关性。通过对HBV-GN患者临床生化及免疫指标的观察及肾脏病理的分类及损害程度,找出HBV复制与肾脏病变及进展间的相关性。HBV基因组全长大约仅3200bp,具有4个开放ORF,各具有不同的功能。在以往的研究中发现,X基因具有反式激活作用,同时也与组织的癌变有关。在HBV与HCC的研究中,X基因及蛋白的作用也被明确。通过HBV基因与肝脏细胞整合后,X基因可被反式激活,其中一个机制可能与基因的突变有关。在众多HCC HBVDNA的研究中发现,存在T1762/A1764双突变,基因突变一方面可导致病毒复制的增加及侵袭性的增强,另一方面可反式激活X基因,通过细胞信号通路,可导致细胞的凋亡,细胞纤维化,细胞过度增殖及肿瘤的发生。因此,HBV X基因与肝脏病变的进展密切相关,特别是肝细胞癌变有直接关系。而HBV-GN与HBV X基因之间的相关性之前未有研究。我们的研究目的之二是进一步探讨HBV-GN患者中是否存在X基因变异,通过抽取HBV-GN患者血清,提取DNA,通过对X基因的测序分析,找到可能的突变基因序列以及可能的致病机制,以及基因突变对疾病的影响,为疾病的诊断及治疗提供帮助。方法：一方面,收集首次发病的HBV-GN患者,根据入选标准：存在不同程度HBV-DNA复制；首次肾脏发病,24小时尿蛋白排泄量大于3.0g；患者eGFR≥60ml/min/1.73m2;患者经检查肝功(ALT, AST)正常,且肝脏影像学检查(超声或CT)无异常；排除其他继发性或原发性肾脏病变的可能性；肾穿刺活检病理证实乙肝病毒相关抗原(HBVAg)沉积,乙型肝炎病毒相关性肾炎的诊断标准；未应用抗病毒药物、糖皮质激素及其它免疫抑制药物治疗。采用荧光定量聚链反应PCR法测定患者血清HBV DNA浓度,根据血清HBV DNA复制水平,分为高、中、低组。收集患者入院及门诊随访过程中各指标包括24小时尿蛋白排泄量、血白蛋白、血胆固醇及甘油三酯、血肌酐、补体C3及C4、ALT及AST。根据尿蛋白水平,作为患者预后的标准,分析不同复制组HBV-GN患者治疗前及治疗后6,12,18个月的治疗效果。同时比较不同病毒复制组患者的膜性肾病病理分期的相关性,以及尿蛋白与病毒复制水平的相关性。根据肾脏病理免疫荧光结果,比较不同复制组患者,HBV相关抗原的沉积率。最后,所有患者加用抗病毒药物治疗,通过18个月的随访观察,比较各组患者肾脏病变缓解率的差别,分析病毒复制水平对HBV-GN患者病变缓解率的影响。另一方面,筛选出未抗病毒治疗的HBV-GN患者,HBV-GN患者由肾穿刺活检病理证实,并且不存在肝脏慢性化病变、肝硬化及肝癌。收集无症状乙肝病毒携带者作为对照组。所有患者静脉采血,分离血清于—70℃冰箱保存。提取患者血清HBV DNA,从基因库下载HBV DNA序列,在X基因保守区设计引物,目的基因位于ntl583-ntl793之间,长211bp。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,经分光光密度仪测定DNA浓度≥50ug/ml后,进行双向序列测定。比较HBV-GN组基因序列的差异,找出热点突变位点,并与对照组进行比对,以及在HBV-GN致病中可能的机制。结果：一血清乙肝病毒DNA定量与HBV-GN患者临床病理表现及抗病毒药物干预后的相关性研究1不同病毒复制组HBV-GN患者的临床病理特征随着血清HBV DNA复制水平的增高,患者24小时尿蛋白排泄量也不同程度的增加,同时患者的血浆白蛋白降低,胆固醇及甘油三酯也随着病毒复制的增加而升高,差别具有统计学意义。血清补体水平随着病毒复制的增加有下降的趋势但差别无统计学意义,血清肌酐随着病毒复制的增加也出现升高,但差别无统计学意义。随着血清HBV DNA复制水平的增高,肾脏病理损害有加重趋势,以其中78例HBV-MN患者分析,分别根据病毒复制水平及病理分期进行分组,比价复制水平高低与病理分期的相关性,随着复制的增多,病理分期也增高,两者存在相关关系,差别具有统计学意义。同时将HBV DNA复制滴度进行对数转换后与患者的24小时尿蛋白排泄量进行统计分析,发现随着病毒复制滴度的增加,尿蛋白的排泄也相应增加,差别具有统计学意义。2HBV-MN患者HBV抗原免疫荧光与HBV DNA滴度的关系所有患者的病理切片均行HBV相关免疫荧光抗体的检测,包括肾脏病理组织中的HBsAg, HBcAg及HBeAg。包含有完整肾小球的免疫荧光切片拍照后的图片采用Imagerpro6.0系统进行图像的处理及分析,测量肾小球截面总的积分光密度值及肾小球截面的面积,根据两者的比值最后计算出平均的光密度值(IOD/area SUM)。分别将HBsAg,HBcAg及HBeAg的免疫荧光平均光密度值与不同HBV DNA复制组进行比较。随着病毒滴度的增加,病毒抗原抗体免疫复合物的沉积增加,差别具有统计学意义。3各组治疗及随访18个月后疗效比较三组患者均接受了抗病毒核苷酸类药物口服治疗,药物服用均超过18个月。在18个月的随访过程中未出现肝功能损害及病毒变异的病例,也无肾功能恶化的病例。比较各组患者6个月,12个月及18个月的24小时尿蛋白排泄量,以24小时尿蛋白的排泄量作为评判患者预后的标准。各组间尿蛋白的平均排泄量均较治疗前明显减少,差别有统计学意义。补体C3及C4水平较治疗前上升,但差别无统计学意义,血肌酐治疗前后无明显变化。计算治疗第18个月各组患者的总缓解率,各组患者的总缓解率存在一定差别。低度复制组与高度复制组总缓解率差别具有统计学意义。二乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎患者病毒X基因变异分析1HBV-GN组HBV X基因突变及相对应氨基酸改变HBV X基因测序结果与C基因型adr血清型HBV基因组序列进行对比,HBV-GN组有42例发生了核苷酸序列点突变,其中5个碱基位点发生了同义突变,未导致氨基酸的替换,分别是nt1585、nt1591、nt1633、nt1675、nt1715;7个位点发生错义突变并导致了氨基酸的替代；42例患者均存在错义突变,错义突变占所有突变的比例为58.5%,占HBV-GN组人数比例为84%。其余8例无突变发生。核苷酸序列错义突变主要发生于以下位点：nt1653、nt1726、nt1727、nt1730、 nt1753、nt1762、nt1764,其中nt1726和nt1727以及nt1762和nt1764位点突变往往同时存在突变,即nt1726/1727双突变和nt1762/1764双突变。将核苷酸序列翻译成氨基酸序列,所检测区段则反映X蛋白70～139位氨基酸。错义突变出现在对应的X蛋白aa94、aa118、aa119、aa127、aa130、aa131。2对照组的基因突变对照组中有5例发生了核苷酸序列错义突变,约占对照组人数的8%,分别是nt1632及nt1635,相应的氨基酸aa87及aa88也发生了替换。3HBV-GN组与对照组DNA定量滴度比较以及将HBV-GN组中有X基因变异的患者的HBV DNA复制水平与对照组进行统计学分析,经对数转换后变为正态分布资料,采用几何均数进行t检验,结果发现两组之间的复制水平未见统计学的差别。4伴和不伴X基因突变HBV-GN尿蛋白定量比较将HBV-GN患者蛋白尿资料纳入比较,由于无X基因变异HBV-GN病例数少,且进行正态分布检测后不符合正态分布,因此采用秩和检验,有或无X基因变异HBV-GN患者间,24h尿蛋白量差异有统计学意义。结论及意义：1首次证实,随着HBV DNA病毒复制的增加,患者的尿蛋白排泄量增多,病理损害加重,HBV DNA复制水平与HBV-GN的病变间存在相关性。2首次证实,随着HBV DNA病毒复制的增加,抗病毒治疗后HBV-GN患者的尿蛋白缓解率降低,临床缓解率下降,两者之间存在相关性。3首次证实,绝大多数HBV-GN患者存在X基因一些关键位点的突变,并导致了氨基酸的替代,突变HBV-GN患者尿蛋白排泄量增加,提示这些关键位点的突变可能在HBV-GN的致病中起到重要作用。