论文部分内容阅读
目的研究薯蓣皂苷(dioscin, Dio)对大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制。方法建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,并用薯蓣皂苷进行干预。将培养的大鼠H9c2心肌细胞随机分为5组,正常对照组(C组)；缺氧/复氧模型组(H/R组)；缺氧/复氧模型+薯蓣皂苷低、中、高剂量(10mg/L、20mg/L、40mg/L)干预组(H/R+L、M、H组)。1.用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法测定细胞存活率。2.收集培养细胞上清液,分别测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。3.应用荧光探针DCFH-DA标记细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS),荧光显微镜下观察各组心肌细胞内活性氧水平。4.采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色法,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.用罗丹明123((Rhodamine123, Rh123)荧光探针标记线粒体,多功能标记仪检测荧光强度以反映细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化。6.采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞内细胞色素C(cytochrome c, Cyt-c)释放量。7.应用RT-PCR方法检测细胞凋亡相关基因Bax、Bc1-2、caspase-9、caspase-3 mRNA的表达。8.应用Western blot法检测热休克蛋白70(heat-shock protein 70, HSP70)的表达。结果1.细胞存活率：与H/R组比较,C组心肌细胞存活率有统计学差异(34.50±8.50% vs 100.00±00.00%,P<0.01),H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞存活率(34.50±8.50% vs 66.47±10.56%,76.19±7.57%,93.38±6.09%,P<0.01)；且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。2. LDH活性：与H/R组比较,C组心肌细胞LDH活性有统计学差异(1287.68±58.97U/Lvs975.29±35.66U/L,P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显降低心肌细胞LDH活性(1287.68±58.97 U/L vs 1150.85±40.67 U/L, 1078.79±48.94 U/L,1001.65±53.05 U/L, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。SOD活性：与H/R组比较,C组心肌细胞SOD活性有统计学差异(17.36±1.12 U/ml vs 23.55±1.19 U/ml, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞SOD活性(17.36±1.12 U/ml vs 19.59±0.60 U/ml,21.08±0.63 U/ml, 22.56±0.59U/ml,P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L组有统计学差异(P<0.05)。MDA含量：与H/R组比较,C组心肌细胞MDA含量有统计学差异(2.88±0.04 nmol/ml vs 2.49±0.03 nmol/ml, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显降低心肌细胞MDA含量(2.88±0.04 nmol/ml vs 2.72±0.06 nmol/ml,2.66±0.05 nmol/ml,2.59±0.03 nmol/ml, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<0.05)。3.活性氧：荧光显微镜下,Rosup活性氧阳性对照组荧光强度最高,H/R组荧光强度较高,与H/R组比较,H/R+L、H/R+M、H/R+H组均可降低细胞荧光强度、减低细胞内活性氧水平。4.细胞凋亡率：与H/R组比较,C组心肌细胞凋亡率有统计学差异(10.61±1.00% vs 0.15±0.04%,P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显减低心肌细胞凋亡率(10.61±1.00% vs 2.03±0.06%,1.80±0.06%,1.67±0.04%, P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<O.05,P<0.01)。5.△Ψm荧光强度：与H/R组比较,C组心肌细胞线粒体膜电位有统计学差异(106547±5907 vs 205486±4653, P<0.01), H/R+L、M、H三组,均可明显升高心肌细胞线粒体膜电位(106547±5907 vs 160835±3521,186350±3353, 194694±3043,P<0.01);且与H/R+H组比较,H/R+L、M组有统计学差异(p<O.01)。6.Cyt-c释放量：与H/R组比较,C组细胞内Cyt-c量差异具有统计学意义(p<0.01),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞线粒体内Cyt-c释放量(p<0.01)；与H/R+H组比较,H/R+L组(p<0.05),各给药组的作用呈显著浓度相关性。7. Bax、Bcl-2 mRNA的表达：与H/R组比较,C组细胞Bax、Bcl-2 mRNA的表达差异具有统计学意义(P<0.05),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞Bax mRNA的表达(p<0.01),并能升高Bcl-2 mRNA的表达(p<0.05)；与H/R+H组比较,H/R+L组(P<0.05),各给药组的作用呈显著浓度相关性。caspase-9、caspase-3 mRNA的表达：与H/R组比较,C组细胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表达差异具有统计学意义(p<0.01),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可减少心肌细胞caspase-9、caspase-3 mRNA的表达(P<0.01)；与H/R+H组比较,H/R+L组(P<0.01),各给药组的作用呈显著浓度相关性。8. HSP70的表达：与H/R组比较,C组细胞HSP70的表达差异具有统计学意义(p<0.05),薯蓣皂苷干预的三组H/R+L、H/R+M、H/R+H组,均可明显升高心肌细胞内HSP70的表达(p<0.05)；与H/R+H组比较,H/R+L组(p<0.01),各给药组的作用呈显著浓度相关性。结论1.薯蓣皂苷可有效减少缺氧/复氧损伤的大鼠H9c2心肌细胞LDH漏出量,提高细胞存活率。2.薯蓣皂苷可通过抗氧化作用有效保护缺氧/复氧对大鼠H9c2心肌细胞的损伤。3.薯蓣皂苷可通过抗凋亡作用有效保护缺氧/复氧对大鼠H9c2心肌细胞的损伤。4.薯蓣皂苷可增加缺氧/复氧损伤后大鼠H9c2心肌细胞HSP70的表达来有效保护细胞。