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研究背景和目的大体积软组织缺损的修复是整形外科面临的最大挑战之一。美国整形外科协会统计数据显示,2015年仅全美就有近576万例修复重建手术,76%源于肿瘤切除术后软组织缺损的修复与重建。根据外科修复缺损的“replace tissue with like-tissue"原则,自体脂肪组织被认为是最理想的软组织填充材料,所以自体脂肪移植被广泛用于美容整形和创伤修复中。然而,由于移植脂肪存活率只有50%左右,可能需要反复多次注射移植从而才能达到比较满意的远期效果。并且脂肪注射移植更适合于部分小体积的软组织缺损,多数的大体积软组织缺损的修复方案仍为传统的自体皮瓣或者脂肪瓣移植。这种皮瓣移植术后都不可避免的造成供区不可逆的畸形和瘢痕。以及受区外形的臃肿,需多次手术修整。这种整形外科传统的“拆东墙补西墙”的修复方案遭到日益增多的质疑,因此,旨在再生出具有功能的脂肪组织的脂肪组织工程,为大体积软组织缺损的修复提供了一条新的途径。脂肪组织工程包括三个至关重要的部分：种子细胞、可降解的支架、以及适当的为细胞生长和脂肪形成提供信号的成脂环境。与传统的脂肪组织工程不同,Morrison团队研发了组织工程室技术,通过将小室置入体内,在小室内置入带血管蒂的脂肪瓣,脂肪瓣会自发成脂形成大体积的脂肪组织。为了可以实现在临床上的应用,Morrison建立了大体积动物模型(猪),单纯利用组织工程室,不添加任何外源性细胞或者其他操作,诱导脂肪瓣生成78.5ml的新生组织,比初始体积增大了5倍以上。但是当移除小室后,脂肪组织的体积增长会停止。利用脂肪组织工程室可以构建大体积、有功能的、带血管蒂可转移的脂肪组织,让工程化的脂肪组织离临床应用的目标又进了一步。这个技术巧妙的利用了脂肪组织的特殊结构,将脂肪组织工程的三大核心要素(种子细胞、支架、成脂环境)都回归到脂肪组织本身,那么是什么因素导致的脂肪组织的自发成脂呢?关于小室内脂肪组织生长的确切机制尚不清楚,根据之前的研究,猜测可能跟以下几个因素有相关性：①良好的血供条件：为组织的生长提供充足的养分,且血运可以带来足够的干细胞参与成脂分化,因此早期及时的血管新生可以促进脂肪新生；②合适的成脂环境；③细胞间接触抑制效应被解除；④小室内力学微环境的改变。小室内的力学微环境的改变到底是怎样对脂肪组织生长产生作用的?通常情况下,人体因为自身的体重和负荷的重量,脂肪组织里的细胞受到各种里机械力的作用,如拉力、张力、切应力等。比如当人体呈坐姿时,臀部脂肪组织受到的最大为30%张力、45%压力和40%切应力；当变成平躺的姿势的时候,臀部所受到的张力为坐姿时候的一半。近年来,在细胞学和分子学水平,关于机械力的感应和传导,以及效应细胞／组织(如骨骼肌、心血管、软骨和结缔组织等)的研究越来越多。有研究发现,脂肪组织中的脂肪细胞和干细胞都具有机械敏感性(mechanosensibility)和机械反应性(mechanoresponsivity)。这些细胞的表面具有机械性感受器(mechanoreceptor/mechanosensor)感受机械力刺激包括：拉力、切应力、压力、流体静力、以及渗透压。细胞通过细胞骨架系统传导机械力,并且将细胞内部的结构连接起来。细胞膜上的粘附斑复合物(focal adhesions complexes),将细胞锚定到ECM或者其他细胞上。粘附斑复合物主要构成是跨膜蛋白(如整合素),在细胞内面锚定细胞骨架。其他蛋白质如蛋白激酶和机械力激活通道也聚集在粘附斑复合物。细胞骨架还可以存储能量,这种存储的能量来源于各种力的平衡,包括外界环境施(ECM和其他细胞)加的力、细胞内部产生的力(细胞骨架的重构)、渗透压和引力。外源性或者内源性的力改变了已排列好的细胞骨架,整个细胞骨架相应位置都改变,与细胞骨架相连的分子和细胞器的形状和相应位置也受到影响。这种连带反应解释静息张力和其波动转化为生化信号的机制。脂肪组织里的细胞将感受到的机械力刺激转化成生化信号,通过Rho-Rho-kinase Pathway、ERK/MAPK signaling、 Cyclooxygenase pathway、Wnt signal等信号通路调控细胞的增殖和成脂分化。在临床工作中,整形外科医生应用机械力诱导组织生长最多的地方就是扩张器,将软组织扩张器置入皮下,通过不断地注水逐渐增加的皮肤的张力,构建出更大面积的皮肤及皮下组织用于创面的修复。美国整形外科医生Khouri研发出利用负压吸引增大乳房体积,实现非手术隆胸,经过临床实验证明通过每天穿戴负压吸引装置10小时,可以达到至少一个罩杯以上的乳房体积增加。这种乳房体积的增加,是因为负压吸引导致的组织水肿、弹性形变形成的假性增大,还是有干细胞参与的脂肪组织新生?如果可以证明这是一个由机械力诱导和参与调控的脂肪组织的再生过程,那么机械力是怎么调控脂肪再生的过程?基于以上科学问题,探讨关于机械力诱导脂肪组织再生的机制,本实验先是研究机械力对ASCs增殖、成脂分化能力,以及促炎症细胞因子表达的影响,通过构建体外负压吸引诱导脂肪组织再生的大鼠模型,观察吸引作用各个时间点的脂肪组织体积,以及利用H&E染色组织学、免疫荧光、Real-Time PCR、 ELISA等技术分析机械力诱导脂肪组织再生的过程及其机制,这对于证明单纯依靠机械力可诱导脂肪组织再生,实现非侵入性构建带血管蒂的大体脂肪组织的意义重大,为临床修复大体积软组织缺损提供新的思路以及实验依据。方法1、机械力对ASCs增殖能力、成脂分化能力以及促炎症细胞因子分泌的影响(1)将机械力作用于ASCs,实验分组如下：①对照组：无拉伸普通培养；②拉伸组：12%、10cycles/min,拉伸培养；③细胞松弛素D组：培养基中加入2μM细胞松弛素D拉伸培养。拉伸培养48小时后,观察细胞形态、Pholloidin染色细胞骨架、MTS实验检测细胞增殖能力。(2)以上3组细胞进行成脂分化诱导,待分化诱导7天后检测PPARy基因表达,12天后分别进行油红O染色,LPL基因表达的检测。(3)利用Western Blotting检测3组ASCs细胞内MIF的表达,ELISA检测培养基中MIF、IL-6的分泌情况。(4)通过Transwell小室(上室为THP-1诱导形成的巨噬细胞,下室为3组ASCs细胞培养基),分析机械力作用下的ASCs分泌的促炎因子对巨噬细胞迁移能力的影响。(5)统计学分析：采用SPSS 17.0软件进行统计分析,数据表示为均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验,显著性检验采用One-Way ANOVA检验,以P<0.05为差异有统计学意义。2、机械力诱导构建预扩张脂肪组织(1)将大鼠腹股沟脂肪瓣转位到腹部,待切口愈合后,放置体外负压吸引装置(负压值为-25 mmHg,10小时／天)构建机械力诱导脂肪组织再生的动物模型。(2)对照组和实验组分别于吸引后1周、4周、8周、12周,实验组于12周移除负压吸引装置4周后取材。(3)脂肪组织标本进行以下检测：①脂肪组织体积的测量；②H&E染色组织学分析；③免疫荧光CD31分析血管密度；④免疫荧光CD34和围脂滴蛋白分析脂肪组织新生；⑤Real-Time PCR分析成脂基因的表达情况；⑥ELISA检测脂肪组织IL-1β,IL-6,TNF-α,和MIF的表达情况。(4)统计学分析：所有数据用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0软件进行数据处理。为比较处理因素和时间的相互影响,对实验数据进行了析因分析。组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。两独立样本均数比较采用t检验。以P<0.05为有统计学差异。结果1、机械力促进ASCs增殖,抑制其成脂分化,上调ASCs分泌促炎症细胞因子①细胞骨架的变化：在对照组中,ASCs随机排列,且细胞骨架也是无规律的随机分布。当ASCs受到机械力拉伸以后,ASCs细胞变得细长,几乎与机械力作用方向垂直排列,细胞骨架也重新有规律的排列,与细胞排列方向平行。当ASCs的培养基中加入了细胞松弛素D后,可以观察到ASCs变成圆形,细胞骨架几乎完全聚集成簇。②通过MTS实验,在检测的48小时和72小时这两个时间点,我们发现拉伸组的细胞增殖率明显高于其他两个组P<0.05,而对照组和细胞松弛素D组之间无显著性差异P>0.05。③油红O染色：对照组中ASCs被定向成脂分化诱导后第5天开始,包浆内出现小的脂滴并逐渐聚集融合成较大的脂滴。细胞形态逐渐发生明显的改变,从长梭形类成纤维细胞外观逐渐变成不规则形状而后变成圆形。成脂分化诱导12天后出现了大量的脂滴,油红O染色后细胞内出现大量红染颗粒,证明镜下所见细胞内颗粒确为脂滴。拉伸组中ASCs成脂分化后诱导第7天,细胞内才开始出现小脂滴,细胞形态也会发生与对照组细胞相类似的改变,且成脂分化诱导12天后包浆内的脂滴也较对照组少。细胞松弛素D组中ASCs跟对照组一致,也是在定向成脂分化诱导后第5天开始,包浆内出现小的脂滴并逐渐聚集融合成较大的脂滴,细胞形态也会发生相类似的改变。成脂分化诱导12天后,油红O染色阳性,镜下观察可见其成脂明显多于对照组。-Time PCR:PPARy和LPL基因水平在拉伸组中表达最低。无论是在成脂分化过程的早期还是后期,细胞松弛素D组的成脂系基因表达始终高于其他两组,而拉伸组的成脂系基因表达更是低于对照组。⑤细胞内外MIF表达情况：通过Western blotting检测ASCs细胞内MIF的表达水平,发现拉伸组的表达量是三组中最高的P<0.05,大约是对照组的3倍。而拉伸+细胞松弛素D组,虽然细胞内MIF表达量比拉伸组有很大程度的降低(相对表达量只有拉伸组的一半左右),但是仍然高于对照组,P<0.05。ASCs培养基中MIF的表达水平则通过ELISA检测,发现MIF在3组的表达情况跟ASCs细胞内的表达情况类似。拉伸组的表达量仍然是三组中最高的P<0.05,而拉伸+细胞松弛素D组,虽然表达量比拉伸组低但是仍然高于对照组P<0.05。看ASCs培养基中IL-6含量：机械拉伸促进IL-6表达增高,是对照组的2.2倍P<0.05。细胞松弛素D处理以后,机械拉伸促进IL-6表达的能力被降低,但是IL-6的表达水平仍然高于对照组P<0.05。⑦利用Transwell小室模型,计数巨噬细胞穿过小室膜上的小孔的细胞数目,检测巨噬细胞的迁移能力。通过结晶紫染色,发现拉伸组穿过小孔的巨噬细胞数目最多,虽然拉伸+细胞松弛素D处理组穿过小孔的巨噬细胞数目会减少,但是仍然多于对照组P<0.05。2、机械力诱导成熟脂肪组织再生①脂肪瓣体积变化：统计学分析显示对照组脂肪瓣体积随时间增加变化不明显,而实验组在第4周后体积随时间增加而明显增长,在第8周和第12周实验组脂肪瓣体积显著大于对照组P<0.05。实验组在负压外吸引12周后去除负压吸引装置,4周后(16周)脂肪瓣体积与12周时比较出现轻度回缩P<0.05。②H&E染色组织学分析：两组各个时间点脂肪瓣组织学结构与正常脂肪组织无明显差异。未发现明显的水肿等征象,是因为不是吸引后即刻取材,而是在撤除负压吸引装置后24小时取材。但是在实验组中,可以观察到比对照组多很多的血管,但是在撤除负压吸引装置以后4周,脂肪瓣中的血管数量也明显减少,恢复到对照组水平。③血管密度：CD31阳性细胞计数血管数目,吸引组脂肪组织中血管密度从4周到12周一直高于对照组P<0.05,当去除外吸引装置以后4周,吸引组脂肪组织中血管密度与对照组无明显差异。④细胞增殖：在吸引后4周时,吸引组脂肪瓣中的细胞有明显增殖(Ki67阳性细胞数量增多),且部分Ki67阳性的细胞CD34染色也呈阳性,说明增殖的细胞中有干细胞,也可能有其他类型的细胞。统计学分析发现,在吸引1周和4周时,吸引组中CD34+/Ki67+细胞数量显著增多,到8周和12周出现下降,但一直都高于对照组P<0.05,当去除吸引装置后,吸引组的CD34+/Ki67+细胞数量恢复到对照组水平。⑤成脂基因的表达：Real-Time PCR检测成脂基因PPARy和CEBP的相对表达量,发现吸引组中成脂基因一直处于高表达的状态P<0.05,但是当去除引装置以后4周,其表达量恢复到正常水平,与对照组无显著差异。⑥脂肪组织中炎性因子的表达：ELISA分析脂肪组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和MIF的表达量,发现随时间变化趋势基本一致,在吸引后1周升高到峰值表达量,随后的12周虽然表达量有所下降,但是仍然维持在一个较高的水平P<0.05。当外吸引装置去除后4周,表达量恢复到正常水平,与对照组无显著差异。讨论人体时刻都承受着各种机械力的作用,如重力、运动时所受到的力、以及血流动力学的力,这些机械力作用于人体对机体的活动产生影响。细胞是如何感受到机械力,然后对机械力做出反应?Donald Ingber用拉张整(tensegrity=tensional integrity)这个概念很好的解释了极为复杂的机械传导路径。根据这个理论,细胞被看做是多功能模块的拉张整体结构。硬的微管(microtubules)作为坚硬的支架,而微丝(microfilaments)和中间丝(intermediate filaments)作为弹性结构。这些结构之间张力和压力的平衡来维持细胞结构的三维整体和外形。因此可以认为细胞通过细胞骨架系统传导机械力,并且将细胞内部的结构连接起来。细胞膜上的粘附斑复合物(focal adhesions complexes),将细胞锚定到ECM或者其他细胞上。粘附斑复合物主要构成是跨膜蛋白(如整合素),在细胞内面锚定细胞骨架。其他蛋白质如蛋白激酶和机械力激活通道也聚集在粘附斑复合物。细胞骨架还可以存储能量,这种存储的能量来源于各种力的平衡,包括外界环境施(ECM和其他细胞)加的力、细胞内部产生的力(细胞骨架的重构)、渗透压和引力。外源性或者内源性的力改变了已排列好的细胞骨架,整个细胞骨架相应位置都改变,与细胞骨架相连的分子和细胞器的形状和相应位置也受到影响。这种连带反应解释静息张力和其波动转化为生化信号的机制。根据整体拉张理论,细胞核作为整个结构的一部分,其内部也是一个封闭的框架体系,通过核膜上的锚固与细胞骨架相连。因此机械刺激可以被直接传导到DNA影响基因转录。细胞外形和细胞功能密切相关,细胞的外形是决定细胞增殖、分化还是保持静止状态的一个至关重要的因素。体外实验证明：当细胞不能伸展处于一个皱缩的状态,细胞可能趋向于凋亡；当细胞被拉伸延展成长梭形,细胞开始增殖；细胞处于这两者中间状态时,可能是处于一个分化的情况。在本实验中,我们也的到类似的结果。在机械力拉伸作用下,ASCs细胞变得细长,几乎与机械力作用方向垂直排列,细胞骨架也重新有规律的排列,与细胞排列方向平行,且相对较与无拉伸的对照组细胞增殖能力增强。当ASCs的培养基中加入了细胞松弛素D后,可以观察到ASCs变成圆形,打破了细胞骨架原有的排列,细胞骨架几乎完全聚集成簇,因此机械力促进细胞增殖的效应也被抵消。根据油红O染色,以及成脂基因PPARy和LPL表达的结果,发现机械力拉伸抑制ASCs成脂分化。并且这样的抑制效果,会因细胞骨架的破坏而抵消。因为机械力的类型、参数不同都会对成脂分化起到不同的作用。一般来说,机械拉力都会促进MSCs成骨分化而抑制其成脂分化。有研究发现,在成脂分化诱导培养基中培养脂肪组织来源基质干细胞,并施加周期性机械拉力,其成脂分化潜能被抑制。这个研究还发现,机械力诱导分化的可能机制是机械力促使ERK1/2磷酸化并激活ERK。另外的研究报道,在成脂分化诱导培养基中培养MSCs并施加周期性机械拉力,MSCs仍然向成骨方向分化,这与Runx2和成骨细胞特异性因子osterix的表达有关。10循环／分钟,2%周期性拉力(每天6小时)施加在细胞上,在成脂分化诱导5天以后,包括PPARy和脂联素等重要成脂系基因的mRNA表达分别被抑制35%和50%,这成脂分化被抑制可能与β-catenin相关的信号通路有关。机械力不仅仅改变细胞形态和排列方向,调控细胞活动,如细胞增殖、分化,还影响多种细胞因子和趋化因子的分泌。机械力以及被广泛应用于不同的组织中,诱导细胞因子的合成。有研究发现将120%多轴向拉力作用于ASCs, ASCs分泌一系列细胞因子。在本实验中,虽然使用的机械力种类不同,但是我们得到了相类似的结果,ASCs在周期性单轴拉力的作用下诱导促炎因子IL-6和MIF的分泌。在拉伸+细胞松弛素D组,IL-6和MIF的表达量都较拉伸组降低,但是仍然高于对照组。这提示我们,机械力是通过改变细胞骨架的排列,从而调控促炎因子IL-6和MIF的分泌。当细胞骨架的结构被破坏,机械力诱导细胞因子分泌的作用会被部分阻断,也就是说机械力不仅仅是通过细胞骨架的重排,还通过别的途径调控细胞因子的分泌。肥胖不仅仅是脂肪组织体积的增加,还和脂肪组织的慢性炎症有关。在组织工程小室的模型中,也发现脂肪组织的早期炎症环境对脂肪组织再生起着至关重要的作用。炎症反正主要以炎症细胞的浸润和炎症因子的分泌为特点。因此本研究中检测的MIF是一种重要的促炎因子,其作用可以归纳为以下几个方面：(1)促进成脂分化、增大脂肪细胞的大小,促进细胞增殖；(2)促进脂肪组织炎症；(3)对炎症细胞的趋化作用；(4)调控巨噬细胞M1极化；(5)上调促炎细胞因子。本实验中,拉伸组中巨噬细胞穿过Transwell小室膜的数目最多,我们考虑这可能与拉伸组MIF和IL-6高表达有关,而MIF和IL-6对巨噬细胞有显著的趋化作用。拉伸+细胞松弛素D组因为MIF和IL-6的高表达被部分阻断,所以巨噬细胞迁移的数目也随之减少。在负压外吸引诱导脂肪组织再生的模型中,因机械力刺激脂肪组织体积出现明显的增长,且去除外吸引装置以后脂肪组织体积出现轻度回缩,但是仍大于初始体积,说明脂肪组织体积的增长是因为脂肪组织生长,而不是因为机械力引起的组织弹性形变和水肿导致的。荧光染色Ki67阳性的细胞数量在实验组中明显增多,这说明机械力引起脂肪组织内细胞增殖,关于这一点与之前的研究结果一致,且在本研究的体外实验也被证明了。Ki67阳性细胞只有部分是CD34染色也呈阳性,说明有干细胞增殖,同时也有其他类型的细胞增殖,可能是血管内皮细胞。因为实验组相较对照组,CD31阳性细胞数也明显增多。CD31阳性细胞数目增多说明吸引组中血管化程度高,这为组织生长提供充足的养分,也运输更多的干细胞。同时CD34阳性细胞数量增多,说明有更多的干细胞可参与成脂分化。Real-Time PCR显示调控成脂过程早期的PPAR γ和晚期的CEBP的表达在吸引组中显著增高,但是当外吸引装置去除4周以后成脂基因的表达水平恢复到正常,与对照组无明显差异,说明机械力促进成脂分化。这里机械力同时促进细胞增殖和成脂分化,看似矛盾,实则不然。我们将细胞增殖曲线和成脂分化趋势曲线合并后(如下图),发现细胞增殖峰值主要是在4周以前,4周后开始下降,而成脂分化的高峰出现在4-12周。这说明,负压吸引产生的机械力在脂肪组织再生的早期的主要作用的是促进细胞增殖,增殖的ASCs为后期成脂分化提供足够的干细胞,增殖的血管内皮细胞参与血管新生,为后期的成脂分化提供良好的血管和细胞来源。到后期,增殖达到顶峰的时候,大量分泌的MIF开始发挥主导作用：第一,诱导ASCs像脂肪细胞分化,促进脂肪细胞内脂滴聚集；第二,上调炎症因子的分泌(如IL-1β、IL-6、TNF-α),促进巨噬细胞浸润,维持脂肪组织一个持续的炎症反应状态,有利于脂肪组织再生。这样为脂肪组织再生提供了两个必备且相辅相成的条件：成脂分化和血管化。负压吸引产生的机械力诱导脂肪组织再生是一个动态而复杂的生物学过程。本实验研究了机械力诱导脂肪组织再生的机制,但是这其中所涉及到的具体的信号通路还有待后续的研究。结论1.机械拉力可促进ASCs增殖,但抑制其成脂分化,这种效应与机械力导致的细胞形态改变、细胞骨架重排密切相关,且会因细胞骨架的排列被打乱、解聚合(细胞松弛素D作用后)而抵消。2.机械拉力可促进ASCs分泌促炎症细胞因子(MIF和IL-6),促炎症因子表达的升高调控巨噬细胞的迁移。3.负压吸引产生机械力在脂肪组织再生的早期,通过使细胞骨架重排,促进ASCs和血管内皮细胞增殖,为后期的成脂分化提供足够的细胞来源和良好的血供条件。到后期,细胞增殖达到顶峰的时候,脂肪组织大量分泌的MIF开始发挥其促进炎症反应和诱导成脂分化的作用,由此成熟脂肪组织实现再生。