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白念珠菌是一种重要的机会型人体致病真菌,形态转换能力是其致病性最重要的决定因素之一,这种形态变化受各种外界刺激和细胞内信号转导途径的调控。Wor1是白念珠菌白-灰形态转换的主要调控因子,是白-灰形态转换所必需的。我们以Wor1为诱饵筛选酵母双杂交文库,初步得到10个Wor1相互作用蛋白,这些蛋白可能涉及多种调控过程。Wor1相互作用蛋白之一Fgr3,在酿酒酵母中没有同源蛋白,突变一个拷贝FGR3会影响白念珠菌菌丝生长。序列分析表明它Fgr3具有SP-RING锌指结构,是一个潜在的SUMO E3连接酶。我们克隆了白念珠菌的AOS1/UBA2和UBC9基因,它们的编码产物是潜在的SUMO E1活化酶和E2结合酶。免疫共沉淀实验证明,Fgr3能够与Ubc9在白念珠菌细胞相互作用。利用原核表达系统表达并纯化Aos1/Uba2、Ubc9△N、Fgr3和Smt3,并用体外试验验证了Aos1/Uba2的SUMO E1活化酶的活性。我们分别敲除和过表达FGR3基因,检测了白-灰转换效率并观察细胞形态和菌落表型,结果表明FGR3基因的缺失降低白菌向灰菌转换的效率,影响灰菌的稳定性,过表达FGR3基因促进白菌向灰菌转变,缺少SP-RING锌指结构域削弱了Vgr3激活灰菌的能力。我们分别利用酵母双杂交系统和免疫共沉淀实验确定了Fgr3与Wor1在体外和体内的相互作用,并进一步研究了FGR3与WOR1在白-灰转换中的相互关系,在wor1缺失株中过表达FGR3不能激活灰菌形成,说明外源表达FGR3不能绕过Wor1而激活灰菌,FGR3基因的缺失能够延缓Wor1对灰菌的激活作用。序列分析表明Wor1蛋白含四个潜在的SUMO化位点K104、K223、K274和K385。我们构建了Wor1的突变体Wor1K104R、Wor1K223R、Wor1K274R和Wor1K385R,并转化到MTLa WOR1/wor1白念珠菌中观察突变体对白-灰转换的影响,发现K274R突变不影响Wor1激活灰菌的功能,而K104R、K223R和K385R突变都大大削弱了Wor1激活灰菌的能力。实验结果说明,Fgr3在白念珠菌的白-灰形态转换中起了重要作用,Wor1蛋白的K104、K223和K385是潜在的SUMO化位点,这些位点的SUMO化可能参与调控Wor1的功能。
我们研究了环境pH值对白念珠菌白-灰形态转换的调控机理。结果表明,efg1缺失株的白灰形态转换受pH调控,pH6.8时efg1缺失株的细胞呈现灰菌状态,而在pH4.5时就转变成白菌。利用同源重组原理在efg1缺失株中敲除WOR1基因,得到efg1wor1双基因缺失株,WOR1基因的缺失并不影响efg1缺失株受pH调控的表型。Northern杂交显示,pH6.8时efg1缺失株中灰菌特异基因OP4被转录表达,而在pH4.5时则被抑制。交配实验的结果与细胞形态的结果相吻合,在pH6.8时交配效率较高,在pH4.5时交配效率很低。在efg1缺失株中过表达Rim101-405能够使细胞克服pH对形态的限制,在中性和酸性pH条件下都呈现出灰菌的状态。这些结果说明,Efg1的缺失促使白念珠菌细胞产生依赖pH的白-灰形态转换模式,这种促进作用是由Rim101信号转导途径介导的。