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目的:
将代谢组学技术引入中药传统药性理论的研究中，以5味典型苦寒中药为切入点，进行实验研究。通过对给药小鼠血清的检测、数据的模式识别以及实验验证，在一定程度上探究苦寒中药的分子机制，为进一步揭示中药药性理论的分子基础提供新的角度和研究方案。
方法:
1苦寒中药对小鼠能量代谢的影响
建立在本课题组对于中药寒热药性的研究基础上，选择其中5味典型苦寒中药进行实验。选取50只小鼠进行苦寒中药连续四天的灌胃，在苦寒中药的干预下，检测其体温变化。通过统计学分析对照组与给药组的体温变化值，加之对小鼠给药后机体状态的实时整体观测，以反映苦寒中药对小鼠能量代谢的影响。
2苦寒中药的代谢组学研究
2.1UPLC-MS对小鼠血清的检测
采集上述实验中小鼠的血清及各部分组织，根据不同实验的需求进行处理及储存。检测血清前优化除杂样品的方法，摸清UPLC-MS检测条件，做好质量控制。通过UPLC-MS对各组小鼠的血清进行检测，收集相关数据并通过检测到的内源性代谢物的分子式、分子量，在TraceFinder软件内进行自建内源性物质数据库，利用其他多个不同的数据库之间相互比对，进行再次确认。
2.2筛选差异代谢物
2.2.1单个苦寒中药的对比分析
分别利用A:黄连组、B:黄芩组、C:黄柏组、D:青蒿组、E:苦参组5组逐一与K:对照组进行PCA(主成分分析)、PLS-DA(偏最小二乘判别分析)、OPLS-DA(正交偏最小二乘判别分析)、聚类分析以及多元化ROC曲线探索性分析，进行数据模式判别。通过PLS-DA方法处理得出各组代谢物的VIP值表，排序后，选择其中大于1的代谢物，通过手动积分计算以及多元化ROC曲线探索性分析的精密度，评判筛选差异代谢物，作为后续步骤所需要的生物标志物。利用所得差异代谢物进行相关性分析与分层聚类分析，观测内源性代谢物的变量信息。以上皆以黄连组与对照组两组比较分析为例，其他各组只附有PCA、PLS-DA、OPLS-DA二维及三维得分图，并附有经各分析方法筛选出的每组血清中的差异代谢物。
2.2.2苦寒中药整体的对比分析
苦寒中药整体与对照组的对比分析分为两部分:一是分组情况下，6组血清通过上述PCA、PLS-DA、OPLS-DA、聚类分析等方法进行分析。二是不分组情况下，把5组给药组(50个样本)作为一个整体与对照组(10个样本)进行统一分析。
2.3相关代谢通路分析
基于上述各给药组与对照组两两比较所筛选出的差异代谢物，查找其变化趋势及出现的次数，找出在每味苦寒中药组中都有所变化的差异代谢物。以这部分共同差异代谢物作为生物标志物进行高通量代谢通路分析。选择代谢通路的影响值Impact＞0.10的通路，认为其与潜在的靶标路径关系密切。
2.4代谢组学网络的构建及潜在靶点预测
利用5组苦寒中药共同的差异代谢物构建代谢组学网络模块，衍射出通路上其他相关内源性物质以及基因。通过对相关代谢通路的分析探讨，预测潜在靶点，选择其中的靶点进行后续验证性实验。
3潜在靶点的实验验证
本部分实验是在基因的层面上利用RT-PCR技术研究苦寒中药干预下小鼠肝脏组织中CYP1A2基因表达的变化。通过基因的表达差异，对代谢物检测的准确性进行验证，初步揭示苦寒中药所引起代谢物变化的分子机制。验证苦寒中药共性作用的发挥与CYP1A2靶点之间的关联性，从而为解释苦寒中药的分子机制提供证据。
结果:
1对小鼠能量代谢的影响
通过实验研究发现，对照组小鼠体温无明显变化，状态一直良好，其能量代谢也无明显改变。而5组灌胃苦寒中药的小鼠其体温具有下降趋势，其中与对照组相比，黄芩组和苦参组的小鼠体温从给药第一天开始，已经具有极显著差异(P＜0.01)。而其他三组分别于第二天，第三天，第四天出现显著差异。对于给药后小鼠状态实时观测方面，对照组小鼠在整个实验过程中状态无明显变化。5组苦寒中药组小鼠从开始给药后发生不同程度的变化。灌胃第1天，黄芩组及苦参组的小鼠已开始表现出食欲下降，对水的摄入量也明显较少。灌胃第2天，各给药组均开始出现进食进水量减少，同时活动量也开始较少。灌胃第3天，小鼠集中在鼠笼一侧，出现明显的扎堆现象，产生畏寒表现，毛色些许暗淡，毛发部分脱落。灌胃第4天，毛发无光泽，出现炸毛并脱落严重，脱落部位的皮肤颜色泛白，表现出明显倦怠，眼睛微张，基本无活动，食量水量大幅度降低。各组小鼠状态逐步变差，持续至给药结束。从体温及小鼠状态表现来看，皆说明苦寒中药对小鼠的能量代谢具有明显的抑制作用，作用趋势基本相同，只是程度上有所差别。
2苦寒中药的代谢组学研究
鉴别和推测出了各组小鼠血清中的代谢物，应用多种分析方法对小鼠血清数据进行分析、整理。发现5组苦寒中药每组逐一与对照组两两比较时，两组之间的分离程度较好且组内较为聚集。说明在同种苦寒中药的干预下，机体的内源性代谢物与对照组相比，发生了较为明显的变化。之后通过5组苦寒中药与对照组的整体分析，发现苦寒中药组间互相靠近，且与对照组分离较远，说明苦寒中药其作用和性质具有一致性，机体内代谢物的变化具有共同规律性可循。通过VIP值及非参数检验筛选出各组中的血清差异代谢物作为生物标志物，筛选后各组差异代谢物个数分别为:黄连组21个、黄芩组15个、黄柏组20个、青蒿组21个、苦参组15个。进而找出了5组苦寒中药的共同差异代谢物共有9个。分别为:Urea、4-Hydroxybenzoicacid、Isocitricacid、L-Valine、Cholesterolsulfate、Palmiticacid、Betaine、Stearicacid、Linoleicacid。利用9个共同差异代谢物进行代谢通路分析，筛选出了与苦寒中药作用发挥密切相关的两条代谢通路，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成通路和亚油酸代谢通路。之后通过构建代谢组学网络模块，预测出相关潜在靶点，讨论并选择亚油酸代谢通路上的CYP1A2靶点进行后续验证。
3潜在靶点的实验验证结果
5组小鼠灌胃苦寒中药水煎液后，与对照组相比较，各组CYP1A2mRNA相对表达量均有所上升，其中黄芩组，黄柏组，苦参组的CYP1A2基因表达明显上升，其差异性尤为显著(P＜0.01)，根据mRNA表达的总体趋势可说明，苦寒中药对于小鼠肝脏组织中CYP1A2基因表达具有上调的影响，根据其变化也可证明代谢组学分析的相关通路及靶点的准确性。
结论:
本研究通过前期苦寒中药对小鼠能量代谢变化的研究，说明苦寒中药作用具有一致性和规律性。鉴于中药的苦寒药性是在中药个药药效基础上的共性抽提，但中药药效是多向性的，不能用单一指标(比如温度)进行评价。因此之后基于代谢组学技术，通过PCA、PLS-DA、OPLS-DA、聚类分析、多元化ROC曲线探索性分析等分析方法筛选差异代谢物，运用拓扑分析、相关性和模块化分析找出与苦寒中药作用机制相关的代谢通路及潜在靶点，表明苦寒中药作用发挥的分子基础，探讨苦寒药性与机体能量代谢的相关性。根据推测靶点进行实验验证，进一步说明机体体温下降，能量代谢的降低可能与CYP1A2靶点相关，这也可能是苦寒中药作用发挥的分子机制之一。同时，检验代谢组学分析相关代谢通路以及代谢物变化的准确性。该研究对中药药性的评价提供了新的技术支持，也为揭示中药药性科学内涵探索出了一条新的研究途径。
将代谢组学技术引入中药传统药性理论的研究中，以5味典型苦寒中药为切入点，进行实验研究。通过对给药小鼠血清的检测、数据的模式识别以及实验验证，在一定程度上探究苦寒中药的分子机制，为进一步揭示中药药性理论的分子基础提供新的角度和研究方案。
方法:
1苦寒中药对小鼠能量代谢的影响
建立在本课题组对于中药寒热药性的研究基础上，选择其中5味典型苦寒中药进行实验。选取50只小鼠进行苦寒中药连续四天的灌胃，在苦寒中药的干预下，检测其体温变化。通过统计学分析对照组与给药组的体温变化值，加之对小鼠给药后机体状态的实时整体观测，以反映苦寒中药对小鼠能量代谢的影响。
2苦寒中药的代谢组学研究
2.1UPLC-MS对小鼠血清的检测
采集上述实验中小鼠的血清及各部分组织，根据不同实验的需求进行处理及储存。检测血清前优化除杂样品的方法，摸清UPLC-MS检测条件，做好质量控制。通过UPLC-MS对各组小鼠的血清进行检测，收集相关数据并通过检测到的内源性代谢物的分子式、分子量，在TraceFinder软件内进行自建内源性物质数据库，利用其他多个不同的数据库之间相互比对，进行再次确认。
2.2筛选差异代谢物
2.2.1单个苦寒中药的对比分析
分别利用A:黄连组、B:黄芩组、C:黄柏组、D:青蒿组、E:苦参组5组逐一与K:对照组进行PCA(主成分分析)、PLS-DA(偏最小二乘判别分析)、OPLS-DA(正交偏最小二乘判别分析)、聚类分析以及多元化ROC曲线探索性分析，进行数据模式判别。通过PLS-DA方法处理得出各组代谢物的VIP值表，排序后，选择其中大于1的代谢物，通过手动积分计算以及多元化ROC曲线探索性分析的精密度，评判筛选差异代谢物，作为后续步骤所需要的生物标志物。利用所得差异代谢物进行相关性分析与分层聚类分析，观测内源性代谢物的变量信息。以上皆以黄连组与对照组两组比较分析为例，其他各组只附有PCA、PLS-DA、OPLS-DA二维及三维得分图，并附有经各分析方法筛选出的每组血清中的差异代谢物。
2.2.2苦寒中药整体的对比分析
苦寒中药整体与对照组的对比分析分为两部分:一是分组情况下，6组血清通过上述PCA、PLS-DA、OPLS-DA、聚类分析等方法进行分析。二是不分组情况下，把5组给药组(50个样本)作为一个整体与对照组(10个样本)进行统一分析。
2.3相关代谢通路分析
基于上述各给药组与对照组两两比较所筛选出的差异代谢物，查找其变化趋势及出现的次数，找出在每味苦寒中药组中都有所变化的差异代谢物。以这部分共同差异代谢物作为生物标志物进行高通量代谢通路分析。选择代谢通路的影响值Impact＞0.10的通路，认为其与潜在的靶标路径关系密切。
2.4代谢组学网络的构建及潜在靶点预测
利用5组苦寒中药共同的差异代谢物构建代谢组学网络模块，衍射出通路上其他相关内源性物质以及基因。通过对相关代谢通路的分析探讨，预测潜在靶点，选择其中的靶点进行后续验证性实验。
3潜在靶点的实验验证
本部分实验是在基因的层面上利用RT-PCR技术研究苦寒中药干预下小鼠肝脏组织中CYP1A2基因表达的变化。通过基因的表达差异，对代谢物检测的准确性进行验证，初步揭示苦寒中药所引起代谢物变化的分子机制。验证苦寒中药共性作用的发挥与CYP1A2靶点之间的关联性，从而为解释苦寒中药的分子机制提供证据。
结果:
1对小鼠能量代谢的影响
通过实验研究发现，对照组小鼠体温无明显变化，状态一直良好，其能量代谢也无明显改变。而5组灌胃苦寒中药的小鼠其体温具有下降趋势，其中与对照组相比，黄芩组和苦参组的小鼠体温从给药第一天开始，已经具有极显著差异(P＜0.01)。而其他三组分别于第二天，第三天，第四天出现显著差异。对于给药后小鼠状态实时观测方面，对照组小鼠在整个实验过程中状态无明显变化。5组苦寒中药组小鼠从开始给药后发生不同程度的变化。灌胃第1天，黄芩组及苦参组的小鼠已开始表现出食欲下降，对水的摄入量也明显较少。灌胃第2天，各给药组均开始出现进食进水量减少，同时活动量也开始较少。灌胃第3天，小鼠集中在鼠笼一侧，出现明显的扎堆现象，产生畏寒表现，毛色些许暗淡，毛发部分脱落。灌胃第4天，毛发无光泽，出现炸毛并脱落严重，脱落部位的皮肤颜色泛白，表现出明显倦怠，眼睛微张，基本无活动，食量水量大幅度降低。各组小鼠状态逐步变差，持续至给药结束。从体温及小鼠状态表现来看，皆说明苦寒中药对小鼠的能量代谢具有明显的抑制作用，作用趋势基本相同，只是程度上有所差别。
2苦寒中药的代谢组学研究
鉴别和推测出了各组小鼠血清中的代谢物，应用多种分析方法对小鼠血清数据进行分析、整理。发现5组苦寒中药每组逐一与对照组两两比较时，两组之间的分离程度较好且组内较为聚集。说明在同种苦寒中药的干预下，机体的内源性代谢物与对照组相比，发生了较为明显的变化。之后通过5组苦寒中药与对照组的整体分析，发现苦寒中药组间互相靠近，且与对照组分离较远，说明苦寒中药其作用和性质具有一致性，机体内代谢物的变化具有共同规律性可循。通过VIP值及非参数检验筛选出各组中的血清差异代谢物作为生物标志物，筛选后各组差异代谢物个数分别为:黄连组21个、黄芩组15个、黄柏组20个、青蒿组21个、苦参组15个。进而找出了5组苦寒中药的共同差异代谢物共有9个。分别为:Urea、4-Hydroxybenzoicacid、Isocitricacid、L-Valine、Cholesterolsulfate、Palmiticacid、Betaine、Stearicacid、Linoleicacid。利用9个共同差异代谢物进行代谢通路分析，筛选出了与苦寒中药作用发挥密切相关的两条代谢通路，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成通路和亚油酸代谢通路。之后通过构建代谢组学网络模块，预测出相关潜在靶点，讨论并选择亚油酸代谢通路上的CYP1A2靶点进行后续验证。
3潜在靶点的实验验证结果
5组小鼠灌胃苦寒中药水煎液后，与对照组相比较，各组CYP1A2mRNA相对表达量均有所上升，其中黄芩组，黄柏组，苦参组的CYP1A2基因表达明显上升，其差异性尤为显著(P＜0.01)，根据mRNA表达的总体趋势可说明，苦寒中药对于小鼠肝脏组织中CYP1A2基因表达具有上调的影响，根据其变化也可证明代谢组学分析的相关通路及靶点的准确性。
结论:
本研究通过前期苦寒中药对小鼠能量代谢变化的研究，说明苦寒中药作用具有一致性和规律性。鉴于中药的苦寒药性是在中药个药药效基础上的共性抽提，但中药药效是多向性的，不能用单一指标(比如温度)进行评价。因此之后基于代谢组学技术，通过PCA、PLS-DA、OPLS-DA、聚类分析、多元化ROC曲线探索性分析等分析方法筛选差异代谢物，运用拓扑分析、相关性和模块化分析找出与苦寒中药作用机制相关的代谢通路及潜在靶点，表明苦寒中药作用发挥的分子基础，探讨苦寒药性与机体能量代谢的相关性。根据推测靶点进行实验验证，进一步说明机体体温下降，能量代谢的降低可能与CYP1A2靶点相关，这也可能是苦寒中药作用发挥的分子机制之一。同时，检验代谢组学分析相关代谢通路以及代谢物变化的准确性。该研究对中药药性的评价提供了新的技术支持，也为揭示中药药性科学内涵探索出了一条新的研究途径。