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目的:本实验先用双酚A处理HepG2细胞建立体外胰岛素抵抗模型,并观察双酚A对MAPK及NF-κB通路的影响。然后在此模型基础上使用植物化学物姜黄素干预,并探讨姜黄素对双酚A体外诱导胰岛素抵抗的改善作用及其机制,为胰岛素抵抗和糖尿病的科学研究及防治提供理论依据。方法:(1)通过MTT实验观察双酚A对HepG2细胞活力的影响,筛选适宜浓度建立胰岛素抵抗细胞模型;观察其对葡萄糖消耗量的影响,用Western blot方法检测胰岛素通路相关蛋白p-IR、p-IRS、p-AKT的表达情况;测定丙二醛判定脂质过氧化程度;用ELISA试剂盒测定炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平,Western blot方法检测COX2的蛋白表达水平;通过Western blot方法检测NF-κB 通路中 p-IKKβ、IκB-α、p-p65 和 MAPK 通路中 p-JNK、p-p38、p-ERK1/2MAPK的表达情况。(2)用JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580、ERK抑制剂U0126和和NF-κB抑制剂PDTC分别处理双酚A诱导的HepG2胰岛素抵抗模型,观察其对葡萄糖消耗量及胰岛素信号通路相关蛋白p-IR、p-IRS、p-AKT的表达情况的影响,验证MAPK和NF-κB信号通路在双酚A诱导胰岛素抵抗过程中的作用。(3)不同浓度的姜黄素与双酚A联合处理HepG2细胞,测定并计算葡萄糖消耗量,同时检测胰岛素通路相关蛋白p-IR、p-IRS、p-AKT的表达情况;测定上清中MDA、IL-6、TNF-α的表达水平,检测COX2的蛋白表达水平;Western blot方法检测 NF-κB 通路中 p-IKKβ、p-IκB-α、p-p65 和 MAPK 通路中 p-JNK、p-p38和p-ERK1/2MAPK的表达情况。(4)为进一步验证,用p-JNK和p-p38共同激活剂茴香霉素,联合姜黄素和双酚A处理HepG2细胞,观察对葡萄糖消耗量及MDA、IL-6、TNF-α水平的影响,以探讨JNK/p38MAPK在姜黄素改善双酚A诱导胰岛素抵抗过程中的作用。结果:1.建立双酚A诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型MTT试验显示双酚A在0-100nM剂量范围内对细胞活力没有影响,在1000nM浓度时显著降低细胞活力。用1nM、10nM、100nM的双酚A处理HepG2细胞5天,与溶剂对照组比较,100nM双酚A处理组葡萄糖消耗量减少。Western blot结果显示双酚A处理组p-IR和p-AKT蛋白表达水平显著低于溶剂对照组,p-IRS1表达水平显著上升。以上结果表明双酚A诱导HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立。2.双酚A诱导HepG2细胞炎症和氧化应激反应通过ELISA方法检测炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)]的水平,通过检测丙二醛(MDA)的水平来判断氧化应激的程度。结果显示炎症因子和丙二醛(MDA)水平与溶剂对照组相比均上升,尤其在双酚A处理浓度为100nM时。Western blot结果显示环氧酶2(COX-2)的表达水平与对照组比也显著上升。提示双酚A能上调HepG2细胞炎症因子和氧化应激指标的表达。3.双酚A激活HepG2细胞MAPK和NF-κB通路Western blot结果显示,在双酚A处理浓度为100nM时,磷酸化的JNK、p38和ERK蛋白表达水平明显上升,同时IκB-α的蛋白表达水平显著下降,磷酸化的IKKβ和p65蛋白表达水平显著下降。综上所述,双酚A能激活MAPK和NF-κB 通路。4.JNK/p38通路在双酚A诱导HepG2细胞胰岛素抵抗的作用分别使用JNK抑制剂(SP600125),p38抑制剂(SB203580),ERK抑制剂(U0126)和NF-κB抑制剂(PDTC),与双酚A联合处理HepG2细胞5天。结果显示,JNK抑制剂(SP600125)和p38抑制剂(SB203580)能逆转双酚A诱导的胰岛素抵抗,而ERK抑制剂(U0126)和NF-κB抑制剂(PDTC)未起到作用。与双酚A单独处理组相比,JNK抑制剂(SP600125)和p38抑制剂(SB203580)与双酚A联合处理组葡萄糖消耗量显著上升,磷酸化的IR和AKT蛋白表达水平上升,而磷酸化的IRS1蛋白表达水平下降。结果提示JNK/p38通路在双酚A诱导HepG2细胞胰岛素抵抗中起重要作用。5.姜黄素改善双酚A诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗用1μmol、2.5μmol和5μmol姜黄素和100nM双酚A联合处理HepG2细胞5天,结果显示,姜黄素改善双酚A所致的HepG2细胞葡萄糖消耗量减少,同时使磷酸化的IR和AKT蛋白表达水平上升,磷酸化的IRS1蛋白表达水平下降。因此,姜黄素改善双酚A诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗。6.姜黄素抑制双酚A诱导的HepG2细胞炎症和氧化应激反应ELISA和MDA检测结果显示,双酚A诱导的TNF-α、IL-6和MDA的增加均被姜黄素抑制。Western blot结果显示,COX-2的蛋白表达水平也显著下降。因此,姜黄素改善了双酚A诱导的HepG2细胞炎症和氧化应激反应。7.姜黄素抑制双酚A激活的MAPK和NF-κB通路Western blot结果显示磷酸化的JNK和p38蛋白水平显著下降,而磷酸化的ERK未下降,同时磷酸化的IKKβ、IκB-α和p65均下降。因此,姜黄素抑制双酚A对HepG2细胞JNK/p38 MAPK和NF-κB通路的激活。8.JNK/p38 MAPK通路在姜黄素改善双酚A诱导胰岛素抵抗过程中的作用用JNK和p38共同的激活剂茴香霉素与姜黄素、双酚A共同处理HepG2细胞5天。结果显示,与双酚A单独处理组相比,姜黄素改善了双酚A诱导的MDA、炎症因子的增加和葡萄糖消耗量的减少,茴香霉素可消除姜黄素的保护作用。结果提示姜黄素是通过JNK/p38MAPK通路发挥其对双酚A诱导胰岛素抵抗的保护作用。结论:本研究旨在探讨姜黄素对双酚A诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的作用及其机制。本研究的结果表明,姜黄素可通过JNK/p38 MAPK通路抑制双酚A诱导的肝癌细胞胰岛素抵抗。