论文部分内容阅读
慢性髓细胞白血病(CML)是髓系造血干细胞异常的恶性克隆性白血病。由Ph染色体产生的具有异常酪氨酸激酶活性的Bcr-Abl融合蛋白是CML发病机制中的关键因素。甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate，IM，商品名格列卫)，作为选择性酪氨酸激酶抑制剂，是目前治疗慢性期CML(CP-CML)最有效的靶向治疗药物。但是，同很多其他抗肿瘤药物一样，耐药现象限制了伊马替尼的疗效。由于耐药性的产生而引起的治疗无效或疗效不充分是伊马替尼治疗CML最主要的问题。
CML的IM耐药机制与大多肿瘤耐药相似。通常包括特异性基因突变和相关蛋白的过度扩增，多药耐药(multiple durg resistance，MDR)基因的产生;外排抗肿瘤药物P糖蛋白(P-gP)的过度表达等。另外，肿瘤的发生和发展不仅与基因结构异常有关，而且还与可逆性的表观遗传改变密切相关。在癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的过度表达可导致去乙酰化作用的增强，核小体变得紧密，不利于一些肿瘤抑制基因的表达。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化，诱导细胞凋亡及分化，发挥抗肿瘤作用。
在以表观遗传修饰为靶标，逆转肿瘤耐药的策略中，我们选择组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)为切入点，深入研究了不同类型HDAC抑制剂对CML的IM耐药逆转作用，以及其调节多药耐药性相关机制。以慢性髓细胞白血病急变细胞株K562为基础，利用IM诱导，获得IM耐药细胞株K562/IMR。多种方法检测鉴定K562/IMR对IM的耐药机制。证实K562/IMR耐药细胞株中Bcr-abl融合基因mRNA水平上升，Bcr-Abl融合蛋白P210表达增加。多耐药基因MDR1 mRNA表达和细胞外排蛋白P糖蛋白(P-gP)的表达及活性增强。同时检测到，HDAC靶蛋白（包括组蛋白H3K9和非组蛋白Foxo转录因子）的乙酰化蛋白水平在Bcr-Abl和P-gP编码基因MDR1启动子区域增加。在IM洗脱（washout）后再次检测特征性融合蛋白，证实耐药基因和蛋白无丢失，确定K562/IMR耐药细胞株获得稳定传代与培养。
以稳定传代的K562/IMR耐药细胞株为基础，加入去乙酰化酶(Histonedeacetylase，HDAC)抑制剂尝试体外逆转IM耐药。通过多种方法证实Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶SIRT1抑制剂sirtinol和Ⅰ、Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA均可逆转IM耐药性。表现为恢复Bcr-Abl和P-gP的表达水平，恢复耐药细胞对IM的药物敏感性，恢复药物在耐药细胞中的积累。同时，Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶SIRT1抑制剂sirtinol和Ⅰ、Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA均可逆转诱发耐药细胞凋亡，形态学检测可见染色质凝集，DNA阶梯，分子水平检测到凋亡通路Caspase的激活，流式细胞仪证实G1期细胞比例增加和典型的凋亡指标，AnnexinV的外翻。
在尝试探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂如何体外逆转耐药细胞株K562/IMRIM耐药的机制研究中，我们发现组Ⅲ型蛋白去乙酰化酶抑制剂sirtinol可以逆转IM耐药的过程中的非组蛋白Foxo转录因子的乙酰化，进而抑制BCR-ABL和MDR1启动子区域的转录。而Ⅰ、Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA主要影响组蛋白H3K9和H4K12乙酰化逆转IM耐药性。
本研究利用耐药系系统研究在慢性髓细胞白血病(CML)治疗过程中，如何形成对IM的耐药性，并且发现Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶抑制剂均可以体外逆转耐药细胞株的K562/IMR的IM耐药，可以诱导耐药肿瘤细胞发生线粒体途径凋亡，并对耐药机制进行了初步探讨，为临床开发逆转慢性髓细胞白血病耐药性的药物提供了新的理论基础。