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研究背景:缺血性脑卒中是一种致残及致死性均高的疾病。脑缺血所致的损伤不仅来自急性期缺血导致的脑损伤,也来自于后期继发的炎症反应造成的脑损伤。目前急性脑缺血的治疗药物仅有溶栓药,对于脑缺血后期的治疗手段十分缺乏。小胶质细胞是脑内介导炎症和免疫的主要效应细胞,其持续激活介导脑缺血慢性期的炎症。激活的小胶质细胞有两种类型,分别称为经典激活(classical activation)的小胶质细胞和选择性激活(alternative activation)的小胶质细胞,一般认为,M1型极化的小胶质细胞可释放多种炎症因子会对大脑神经功能恢复将产生有害作用;而M2型极化的小胶质细胞被认为具有抗炎作用。因而调整小胶质细胞的激活状态(极化类型)可能作为抗脑缺血损伤治疗的靶点事件。烟酰胺磷酸核糖转移酶(NicotinamidePhosporibosyltransferase,NAMPT),又被称作内脏脂肪素(visfatin)和前B细胞克隆增强因子(Pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF),是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)补救合成途径的限速酶,NAMPT通过NAD及NAD依赖的酶(如Sirtuins、PARPs)在细胞物质能量代谢、衰老、炎症、免疫等过程中起重要作用。NAMPT在体内广泛存在,并可被外周炎症细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞等释放,而进一步参与外周炎症过程;NAMPT特异性抑制剂FK866被报道有明显的抗炎作用。在中枢,NAMPT主要表达于神经元,胶质细胞不表达NAMPT。因而,有关NAMPT在中枢炎症中的作用,如其在脑缺血后的炎症中的作用报道很少。我们实验室发现,在老年小鼠脑内,NAMPT大量表达于小胶质细胞,而长期慢性的中枢炎症是老年脑的主要特征之一;另外,我们还发现,NAMPT在大鼠脑缺血急性期不表达在小胶质细胞,但在大鼠脑缺血后期,小胶质细胞大量表达NAMPT,而星形胶质细胞始终不表达NAMPT;脑缺血后脑脊液中NAMPT水平升高;我们推测,脑缺血后期小胶质细胞大量表达NAMPT与小胶质细胞介导的慢性炎症有关,而脑缺血后脑脊液中高水平的NAMPT除来自损伤的神经元和外周的NAMPT经损伤的血脑屏障渗入外,还可能来自小胶质细胞的释放,这些释放的NAMPT也参与了小胶质细胞介导的缺血慢性期炎症。因而,本课题关注以下问题:1)小胶质细胞诱导表达的NAMPT是否参与调控小胶质细胞介导的脑缺血慢性期的炎症,其涉及的机制有哪些?2)在缺血和炎症条件下,小胶质细胞能否释放NAMPT?小胶质细胞释放NAMPT的具体出胞机制是怎样的?研究目的:探讨在整体脑缺血过程中及离体缺血条件下,小胶质细胞表达的NAMPT对脑缺血慢性期炎症的调控及其作用机制;在缺血和炎症条件下,小胶质细胞释放NAMPT的出胞途径及其影响因素。研究方法:第一部分:以NAMPT抑制剂FK866侧脑室注射预给药,大鼠局灶性脑缺血再灌注处理(MCAO 1h/R14d)后,以行为学检测反映大鼠神经功能损伤/恢复情况,脑片免疫组化、免疫荧光染色观察神经元存活、星形胶质细胞及小胶质细胞激活情况;以缺糖缺氧再恢复(OGD1h/R24h)处理原代培养小胶质细胞,用免疫荧光染色观察原代大鼠小胶质细胞NAMPT的表达情况;以FK866预处理给药,原代大鼠小胶质细胞OGD1h/R24h处理后,观察细胞形态变化;以不同浓度FK866预处理给药后,以OGD1 h/R 24 h处理小鼠小胶质细胞株BV2细胞,观察BV2小胶质细胞形态变化,检测小胶质细胞内炎症因子的释放;以OGD1 h/再恢复0-24 h处理BV2细胞后,检测BV2细胞内M1与M2型标记物的表达;以FK866预处理给药后,以OGD1 h/R 24 h处理BV2细胞,检测BV2细胞内M1与M2型标记物的表达;以OGD1h/R24h处理BV2细胞,检测胞浆和细胞核的NF-κB表达水平;以FK866预处理,检测OGD1 h/R 24 h处理后胞浆和细胞核NF-κB表达水平变化;以NF-κB抑制剂做预处理,在OGD1 h/R24 h处理BV2细胞后,检测炎症因子TNF-α、IL-6和NAMPT的表达。第二部分:原代大鼠小胶质细胞以OGD 1h/R24h处理后,免疫荧光染色观察NAMPT细胞内分布和表达,ELISA检测细胞释放NAMPT,同时检测细胞处理后培养基上清LDH活性变化,以及PI染色鉴定细胞坏死;采用体外模拟缺血条件(OGD/R)以及以炎症条件(TNF-α)单独或联合应用小胶质细胞释放刺激因子ATP处理BV2细胞后,以免疫荧光染色联合特定标记分子确定法,检测NAMPT与溶酶体、多种内体是否存在共定位;以透射电镜观察BV2细胞的囊泡释放,并通过囊泡直径测量初步确定BV2细胞经以上处理后释放大量外泌体;以免疫电镜观察BV2初步确定NAMPT通过外泌体途径释放;采用超速离心法或商业性外泌体提取试剂盒方法收集细胞上清中的外泌体后,以Western blotting方法检测外泌体中NAMPT的量;以磷脂酶D抑制剂预处理后,以OGD/R联合ATP处理BV2细胞,并提取细胞上清中的外泌体,以Western blotting检测外泌体中NAMPT量的释放量变化。研究结果:第一部分小胶质细胞表达的NAMPT对脑缺血慢性期炎症的调控作用及其作用机制在整体动物实验中,NAMPT抑制剂FK866(10 nM)侧脑室预给药可改善局灶性脑缺血再灌注(MCAO1 h/R 14 d)所致的大鼠神经功能下降,减小脑梗死体积,提高神经元存活率,抑制胶质疤痕形成,抑制小胶质细胞激活和增殖;在原代培养的小胶质细胞上,离体缺血条件——缺糖缺氧再恢复(OGD1 h/R24h)可诱导原代小胶质细胞激活并伴随NAMPT上调表达;FK866(1 nM)预处理可抑制OGD 1 h/R24 h诱导的原代小胶质细胞形态变圆和激活;在小鼠小胶质细胞株BV2细胞上,FK866(0.001-1 nM)抑制OGD 1 h/R24 h诱导的BV2细胞形态变圆及 TNF-α、NAMPT、IL-6 的释放;FK866 可逆转 OGD1 h/R 0-24 h 诱导 BV2 细胞的M1型极化的标记分子TNF-α、IL-6的mRNA的表达上调和M2型极化的标记分子CD206、Arg-1的mRNA的表达下调水平;FK866(1 nM)可显著抑制OGD1 h/R24 h诱导的BV2细胞NF-κB核移位;NF-κB的抑制剂PDTC(50 μ)可部分逆转OGD1 h/R24 h诱导小胶质细胞M1型极化。第二部分缺血和炎症条件下小胶质细胞释放NAMPT的出胞途径及其影响因素OGD/R处理可诱导原代小胶质细胞主动释放NAMPT;免疫荧光染色结果表明,NAMPT与溶酶体、自噬体、内体无共定位;以OGD/R或TNFα处理BV2细胞后,NAMPT在细胞内发生移位(向胞膜下分布),而OGD/R或TNFα合并应用ATP能使细胞表面"长出"有大量NAMPT阳性的小囊泡;对以透射电镜获取这些囊泡的照片,进行分析,发现大部分小泡直径在100 nm左右,与外泌体的大小相符;免疫电镜结果可确证BV2细胞释放的,这些外泌体很多是NAMPT阳性的;以超速离心收集这些外泌体,并进一步做免疫印迹检测,发现NAMPT在外泌体中大量表达;这充分说明,BV2细胞通过外泌体释放NAMPT;我们还发现磷脂酶D抑制剂1-butanol能够抑制NAMPT通过外泌体释放,说明磷脂酶D参与调控NAMPT的释放。结论:1.脑缺血后期小胶质细胞诱导表达并释放NAMPT;抑制小胶质细胞的NAMPT可通过逆转脑缺血诱导的小胶质细胞M1型极化和小胶质细胞内NF-κB的激活,而减轻脑缺血后期小胶质细胞介导的炎症。2.缺血和炎症条件可诱导小胶质细胞通过外泌体途径主动释放NAMPT,且磷脂酶D参与调控NAMPT的释放。