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目的:反义药物是一类经人工合成并修饰或构建反义载体表达的寡核苷酸片段,长度多在15 ~ 30 mer的范围内,它通过Watson-Crick碱基配对原理与靶mRNA的互补区域结合,激活内源性RNase H剪切破坏靶mRNA,从基因转录水平上干扰致病蛋白的产生,从而达到治疗疾病的目的。干扰靶mRNA表达的序列特异性HER-2/neu反义寡核苷酸(ODNs)是一种潜在的乳腺癌治疗药物,有研究表明HER-2/neu反义寡核苷酸能特异的下调p185HER2/neu产物表达并抑制乳腺癌细胞增殖。在之前的研究中,我们针对HER-2/neu mRNA的不同区段设计了若干条ODNs,并进行了系统的体内体外抗肿瘤活性与构效关系分析。结果表明这些反义ODNs的活性强弱差别迥异,ODNs的序列组成与高级结构对其活性有显著影响。在本研究中,我们选取其中4条活性明显不同的序列:HA-2741、HA-824、HA-193和HA-1027,研究其对靶基因表达抑制的时相性变化和在p185HER2/neu高表达靶细胞株SK-BR-3内微观分布的时相性变化的相关性。方法:化学合成硫代反义寡核苷酸(S-ODNs)和6-羧基荧光素(FAM)标记S-ODNs(FAM-S-ODNs)由上海生工生物工程技术服务有限公司完成并PAGE纯化。以加入无血清无双抗1640培养基为空白对照组,用脂质体转染试剂将S-ODNs转染进入靶细胞为实验组。转染后一定时间,用TRNzol试剂提取细胞总RNA,用DNA酶I处理提取的RNA样品,去除残留的基因组DNA污染,进行逆转录反应。用荧光实时定量PCR SYBR Green I染料法对靶mRNA进行半定量检测。用β-actin mRNA作为定量内标,HER-2/neu mRNA表达量的计算采用Pfaffl相对定量法,公式:用western印迹检测各组转染后一定时间p185HER2/neu表达量。按3×105细胞/皿的密度将细胞接种至激光扫描共聚焦显微镜观察用特制35 mm小皿,转染FAM-S-ODNs后一定时间,4%多聚甲醛固定细胞,RNase A处理,碘化丙啶染色后在激光扫描共聚焦显微镜下观察记录。结果:荧光实时定量PCR和Western印迹检测结果显示,4条序列不同的S-ODNs抑制活性具有显著差别,其中HA-2741的抑制活性最强,HA-824和HA-193居次,而HA-1027最弱,而对HER-2/neu mRNA转录抑制和p185HER2/neu蛋白翻译抑制的时相性变化趋势基本一致。4条序列对HER-2/neu mRNA转录抑制的最强时间点均出现在48 ~ 72 h之间,转染后72 h,4个实验组的HER-2/neu mRNA表达量相对空白对照组在0.34 ~ 0.65之间。Western印迹对靶蛋白表达量分析结果和实时定量PCR结果基本一致,4条序列对p185HER2/neu蛋白翻译抑制的最低点均出现在48 ~ 72 h之间,此后表达量逐渐恢复。激光扫描共聚焦显微镜观察各时间点FAM-S-ODNs在SK-BR-3细胞中的分布结果显示,经脂质体转染后早期,HA-2741、HA-824迅速大量呈弥散状分布在细胞核中,并形成亮点状硫代磷酸酯寡核苷酸小体,少量呈点状分布于细胞质;而HA-193、HA-1027则主要呈点状分布在细胞质,少量分布于细胞核。转染后72 h,绿色荧光基本消失。结论:本研究发现,经脂质体转染的S-ODNs可同时分布于细胞核与细胞质中。抑制活性不同的S-ODNs亚细胞分布也有显著差别,且分布变化特点与其对靶基因表达的抑制活性具有对应关系。在转染早期的24 h内,HA-2741、HA-824迅速大量弥散分布于细胞核中,少量呈点状或团块状存在于细胞质,特别是接近细胞核的区域。而HA-193、HA-1027则主要呈点状分布在细胞质,少量分布于细胞核。转染后48 h,HA-824仍大量存在细胞核中,而细胞核中的HA-2741有所减少,HA-193则有所增加,这与ODNs对HER-2/neu mRNA转录抑制的结果呈现出一致性,即HA-824的抑制作用持续较久,而HA-193的抑制作用出现较晚。转染后72 h,细胞内只有少量绿色荧光呈散点状分布,说明S-ODNs大部分已被细胞代谢降解,胞浆内的点状绿色荧光可能是被转运入溶酶体的含荧光基团代谢产物。以上亚细胞分布观察结果和S-ODNs的抑制活性呈现相关性,即高活性的HA-2741和HA-824在细胞内持续时间较长,而活性较低的HA-193和HA-1027持续时间相对较短。可以推测,活性较高的S-ODNs与靶mRNA结合较紧密,可以更多或更持久地存在于细胞核中发挥作用,而低活性S-ODNs则由于和靶mRNA亲和力较弱,更容易被核酸酶降解。但S-ODNs与靶mRNA究竟如何接近与结合,以及为什么会出现均相与点状分布的差异,尚有待进一步深入研究。