论文部分内容阅读
流感病毒是一种高传染性的病毒，可导致全球范围内的流行传播。每年，约有3到5百万重症流感患者并有2.5到5万人因此死亡。近年来，新型流感病毒不断出现，一些禽流感病毒跨越种间屏障造成人类感染甚至人际间传播，包括2009甲型H1N1流感病毒(2009pH1N1)、H5N1、H5N6、H6N1、H7N9和H9N2等，给人类健康造成了威胁，并造成了重大的经济损失。T细胞免疫在流感病毒感染的控制和病毒清除中发挥着重要的作用。流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)变异率高，常使得已有抗体不能有效识别新型抗原。而T细胞识别的免疫原相对保守，主要为流感病毒内部蛋白如M1、NP、PB1及PA等。对于不同亚型流感病毒之间的T细胞交叉免疫反应研究非常重要。 由于季节性流感的流行，健康人中广泛存在着流感特异性T细胞。为了探究季节性流感对不同禽流感病毒的交叉免疫的差异水平及原因，以及这种交叉免疫是否产生相应保护作用，我们对健康人群中流感特异性T细胞对不同禽流感病毒(H5N1，H6N1，H7N9和H9N2)的交叉免疫反应进行了研究。首先，通过血清学检测发现，约50％的健康人对于2009pH1N1的抗体水平为阳性，然而，并未检测到其他禽流感的特异性抗体，这提示着季节性流感pH1N1感染产生的抗体对禽流感无交叉反应。我们进一步利用2009pH1N1和禽流感病毒以及T细胞优势免疫原M1蛋白多肽库分别对2009pH1N1的抗体阳性健康人的外周血淋巴细胞进行刺激，并检测其T细胞免疫反应水平，同时利用流式细胞术分析流感特异性T细胞亚群记忆表型。结果表明机体对禽流感病毒存在一定程度的交叉T细胞免疫反应，而产生效应的T细胞群主要为效应记忆性CD8+T细胞。然而，2009pH1N1特异性T细胞对不同亚型禽流感的交叉反应水平并不相同，主要表现为针对H5N1病毒的交叉反应显著较高，对其他禽流感病毒特别是H7N9反应相对较弱。为进一步探究这种对不同禽流感病毒呈现的不同程度T细胞交叉免疫反应的分子机制，我们对流感内部蛋白的序列及T细胞表位序列进行了生物信息学分析，发现了一个在H1N1和H5N1中保守，而在其他亚型禽流感中不保守的表位区域。通过解析该区域中一条M1蛋白来源的T细胞表位多肽P25与HLA-A*2402复合物的晶体结构，揭示了T细胞表位突变带来的这种免疫原性差异的分子基础。由于不同禽流感亚型的多肽表位发生不同程度的突变，导致被呈递的多肽在MHC结合槽中的构象发生扭转，一方面影响了其复合物的稳定性，另一方面影响了TCR的识别效率，从而影响T细胞免疫反应。为了探究季节性流感pH1N1对禽流感的免疫反应差异对于免疫保护的影响，我们进一步通过小鼠模型来观察预感染pH1N1的小鼠对H5N1和H7N9感染的免疫保护作用。结果发现预感染pH1N1确实对禽流感的二次感染有保护作用，但保护效率有所不同，这种差异也与细胞水平的免疫反应差异相一致。这对流感的预防控制及广谱疫苗的研发奠定了理论基础。 另外，2009年以来，pH1N1甲型流感的全球大流行，造成了约两万名患者死亡，而病毒性肺炎是致死的主要原因之一。探究流感病人在急性期和恢复期中T细胞特征及其与重症肺炎等临床指征的关系非常重要。而自2013年出现的H7N9感染往往导致重症疾病，我们对H7N9感染者康复后的T细胞免疫状态了解甚少。为了探究流感病人在不同疾病进程期中T细胞的特征及其与临床指标的关系，我们对急性期和恢复期的pH1N1流感病人及H7N9康复者细胞免疫状态进行了研究。 在2012-2014年的两个流感流行季，我们对pH1N1患者在急性期和恢复期的细胞免疫状态进行了研究，并对我国六个省市2013-2014年（H7N9最早的两个流行季）的H7N9康复病人进行了为期一年的随访研究。结果发现，在急性期，重症患者中CD8+效应T细胞表现出更高的免疫反应;而在恢复期，其效应记忆性CD4+T细胞免疫反应较强。其外周血中的流感病毒特异性T细胞与肺损伤和疾病严重程度指标呈正相关，并受多种抑制性免疫分子调节。我们的研究对流感病毒性肺炎的病原免疫学及诊断和免疫干预治疗奠定了基础。在H7N9康复病人进行为期一年的随访研究中，感染H7N9后特异性免疫记忆重建有延迟。康复一年左右时病毒特异性T细胞的高活性功能和表型特征可能预示着免疫保护在这个过程中完成了重建。而免疫抑制分子TIM3和LAG3在前6-8个月的表达异常可能与H7N9延迟的免疫重建相关。本研究揭示了H7N9重症感染者康复后，病毒特异性记忆细胞的延迟免疫重建特征，也为H7N9疫苗的设计开发奠定了基础。 此外，我们还对健康人对于H7N9的交叉免疫反应进行了研究，并分析了HLA-A*1101和HLA-A*3303的交叉递呈机制，发现抗原决定性位点的突变可能是H7N9免疫原性改变的一个重要因素。由于不同HLA分子的结构特点不同，交叉递呈多肽具有偏好性，这为流感病毒的免疫入侵机制研究奠定了基础。 综上所述，本研究对健康人中季节性流感对不同禽流感的差异交叉反应进行了系统性的研究。另一方面，本研究揭示了流感病人在急性期、恢复期及康复后的细胞免疫状态特征。这对于流感病毒的防控及基于异质性保护的广谱疫苗的研发非常重要。