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骨关节炎是一种发病率高、严重影响中老年人群生活质量的慢性退行性疾病。主要病理改变为关节软骨组织退化,发病机制与基质金属蛋白酶与金属蛋白酶抑制物比例失衡,局部炎性介质产生增多,导致胶原纤维破坏、蛋白聚糖分解代谢增强有关。植物化学物质Genistein属于黄酮类化合物,具有较强抗氧化、抗炎症反应能力,对关节软骨细胞炎性损伤有一定的保护作用。目的:本研究拟通过兔关节软骨细胞的体外培养,并采用脂多糖干预诱导兔软骨细胞损伤,以建立体外模拟骨关节炎软骨细胞生长模型。利用上述细胞模型,本研究将进一步观察Genistein对经LPS处理的软骨细胞活性、炎症因子产生的调节作用,以了解Genistein对软骨细胞的保护作用及可能机制。方法:第一部分:选取一月龄新西兰兔,处死后在无菌条件下切取兔胫骨近端、股骨远端及近端关节面软骨,采取机械分离结合酶消化结合的方法获取足量软骨细胞,培养于10%胎牛血清的DMEM高糖型培养基,倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,并采用化学染色及免疫组化染色对软骨细胞进行鉴定。用脂多糖处理细胞,MMT实验测定软骨细胞活性,并采用试剂盒、RT-PCR方法检测软骨细胞损伤过程中相关炎症介质一氧化氮(NO)、白介素-1β(IL-1β)的表达水平。第二部分:为进一步观察Genistein对软骨细胞的保护作用,稳定传代的细胞分为正常软骨细胞组,脂多糖单独处理组,脂多糖+雌激素处理组,脂多糖+不同剂量Genistein处理组(选取Genistein剂量为0.1μg/ml~25.0μg/ml)。根据MTT实验绘制各组细胞生长曲线,比较软骨细胞活性。提取各组细胞总RNA,经RT-PCR实验测定相关炎性介质IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、Ⅱ型胶原、p53基因的表达。结果:第一部分:在成功建立体外关节软骨细胞培养体系基础上,采用脂多糖处理细胞,造成细胞炎症损伤模型,细胞增殖活性降低,NO产生增多、IL-1β表达增高,提示体外模拟骨关节炎的软骨细胞模型建立成功。第二部分:利用LPS诱导的体外关节软骨细胞损伤模型观察Genistein对软骨细胞作用的实验结果提示,LPS对软骨细胞增殖活性产生显著抑制作用。在处理早期,LPS能显著刺激炎性介质IL-1β表达,并通过提高iNOS表达增加NO水平,对MMP-1和p53表达也有促进作用。对LPS诱导的软骨细胞增殖活性受抑,Genistein未表现明显逆转作用,高剂量条件下表现为抑制细胞增殖活性作用。低剂量Genistein与雌性激素处理组炎性介质IL-1β、iNOS、MMP-1、p53表达虽然仍高于正常软骨细胞,但与LPS单独处理相比,均表现为表达水平降低的特点。II型胶原表达水平表现出稳定甚至因为损伤因素呈现微弱增高的特点。结论:以脂多糖处理体外培养的关节软骨细胞能导致炎症损伤,表现为细胞活性降低,炎性介质产生增多,可作为研究骨关节炎的较为理想的体外细胞模型。LPS作为损伤因素对软骨细胞增殖活性产生显著抑制作用,结合对相关基因表达调节的结果,显示了LPS在诱导炎症反应、增加基质降解和诱导软骨细胞凋亡方面的作用特点。对LPS已经造成的软骨细胞损伤,Genistein对细胞增殖活性未表现明显逆转作用,但从调节基因表达结果看,低剂量Genistein与雌性激素类似,表现出降低炎性介质、减少iNOS生成、降低软骨蛋白酶、抑制凋亡的特点。软骨细胞特征性标志物II型胶原表达水平维持正常或微弱增高的特点提示软骨基质降解破坏增强是OA病理过程中更为主要的原因。