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肿瘤治疗过程中的大多数化疗药物缺乏对肿瘤组织的高选择性，往往在对肿瘤组织发挥作用的同时也对机体的正常组织产生毒副作用。因此，高特异性的导向化疗成为目前肿瘤治疗研究的重要课题之一。肿瘤导向治疗理论上可以解决这些问题，尽管研究不断深入，但许多“抗体-毒性药物”偶联物研究方案的临床体内应用试验结果显示，其抗肿瘤作用的治疗效果并不十分满意，距预期目标仍有相当的差距。偶联物并不能非常有效地到达肿瘤部位发挥作用，可能的原因有：①一定量的抗体所携带的药物数量有限；②抗体与毒性药物形成大的“抗体-药物”交联物，难以有效地到达实质性肿瘤部位；③“抗体-药物”交联物分子较大，易引起免疫反应，影响其在临床治疗中的应用。 抗体导向酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrugtherapy,ADEPT)是近年来肿瘤抗体导向治疗研究中一项引人注目的新进展。前体药物是一类本身无活性或活性很低、但经酶催化可在体内转化为活性物质的药物。ADEPT利用针对肿瘤抗原的特异性抗体作为载体，携带前体药物的专一性活化酶，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内被抗体所携带的酶转化为活性细胞毒分子，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。文献报道，每分子羧肽酶G2(carboxypeptidase G2,CPG2)一秒钟第四军医大学硕士学位论文可降解800分子苯甲氨酸氮芥底物，提供了放大作用，使活性药物高浓度定位于肿瘤靶部位，这样就可以弥补临床应用中免疫交联物结合力低的缺点，从而发挥对肿瘤的杀伤作用。 ADEPT这一概念最初由Phi1Pott提出并经Bagshawe和Senter进一步发展，自1987年问世以来，愈来愈多的学者不断对其进行试验和研究，目前国内外正处于研究和完善阶段。用于治疗结肠癌的CPGZ系统已经进入了临床n期试验，在结肠癌的治疗研究中显示出较好的疗效和应用前景。其他ADEPT方案，如p一葡糖昔酸酶系统、青霉素酞胺酶系统、胞啼吮脱氨酶系统等也都在进行研究和改进。 前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤之一，在美国占男性肿瘤发病率首位，随着人均寿命及饮食结构的改变，我国前列腺癌的发病率呈逐年上升的趋势。但它的非手术治疗尚无一种较理想的方案，非常需要对其进行新的治疗方案的探索研究，ADEPT就是正在研究的一种探索性的治疗方案。本实验室应用梭肤酶AI(c arboxypePtidase Al，cPAI)针对前列腺癌的ADEPT疗法的研究已经进行多年，具有良好的研究基础。我室合成了两种前体药物氨甲喋吟一Q一肤衍生物:氨甲喋吟一a一苯丙氨酸(MTX一“一Phe)和氨甲喋吟一“一精氨酸(MTX一。一rg)。体外细胞细胞毒试验表明，经CPAI水解后，MTX一a一Phe转化为MTX，其细胞毒活性大于前体药物约1000倍。用抗人精浆蛋白单克隆抗体一CPA交联物 (E4B似。Ab一CPA)进行前列腺癌动物模型的体内试验，抑瘤率达87.6%。 CPAI系统对与前列腺癌治疗的试验研究己取得一定进展，但CPAI基因序列较长，与抗精浆蛋白单链抗体构建成融合基因后，由于分子量较大，表达效率低，较难得到具有活性且具备一定量的融合蛋白。 文献报道计算机模拟的C队1活性中心，与CPAI全酶基因相比减少了一半的碱基数。因此在已有的研究基础上，以CPAI活性中心为突破点，分别克隆并构建CPAI全酶及其活性中心的原核表达载体:pGEX一C队1、pGEX一C队1 activc center，并成功表达了这两种目标蛋白。经第四军医大学硕士学位论文计算机扫描分析，CPAI及CPAI。ctiv。。enter重组蛋白的表达量分别为23.2%和27.1%。表达蛋白以包涵体形式存在，通过对其进行复性、纯化，将最终得到的CPAI全酶及活性中心蛋白进行活性分析。M竹试验和软琼脂集落形成试验结果表明，与商品化的CPAI相比，C队1全酶的蛋白表达产物的活性与其相近，CPAI活性中心蛋白表达产物具有一定的催化活性，但活性较低。 综上所述，本研究通过分子生物学技术成功表达了CPAI全酶及活性中心蛋白。将两种复性后的包涵体蛋白进行体外细胞毒试验，分析其活性。CPAI活性中心蛋白表达产物具有一定的催化活性，表明可以以此计算机模拟的活性中心为基础，通过进一步的改进，如分段延伸其两端的基因序列，再进行克隆、表达与鉴定，或对其进行某些碱基的突变，最终筛选并确定CPAI最小活性结构域。对CPAI活性中心基因的克隆表达及活性分析目前尚未见报道，以此为契机进一步对其进行优化，将是对按肤酶Al系统进行完善一个重大突破。