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中介蝮(Gloydius intermedius)为蝰科蝮亚科毒蛇,是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇,广泛分布于我国西北和华北地区。蛇毒磷脂酶A2(Snake venom phospholipase A2, svPLA2)是蛇毒液中毒性最强的组分之一,除酶活性外,还表现出多种毒理药理学活性,具有潜在的利用价值。但是,关于中介蝮蛇磷脂酶A2神经毒素的毒理学活性、结构与功能的关系、作用机理等有待阐明,而分离获得PLA2神经毒素是解决这些问题的前提。本论文的研究内容及结果：1.中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化(1)凝胶过滤层析利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离,缓冲液为50mmol/L碳酸氢铵(pH8.0),分离得到5个蛋白峰(P1-P5)。分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个峰组分的蛋白纯度。结果表明,P2与P3为磷脂酶A2神经毒素,而P1、P4、P5中均不是磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析表明这两个目的蛋白峰不是单一条带,因此需要进一步分离。(2)阴离子交换层析利用HiTrap DEAE阴离子交换层析柱对P2和P3做进一步的分离纯化,先用A液(50mmol/L醋酸铵,pH7.3)洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液(50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH7.3)进行线性梯度洗脱。收集各个穿透峰及洗脱峰,分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5、P3-2和P3-3为PLA2神经毒素,SDS-PAGE分析表明P2-5、P3-2和P3-3不是单一条带,仍需进一步的分离纯化。(3)阳离子交换层析利用HiTrapCM阳离子交换层析柱对P2-5、P3-2和P3-3进行分离纯化,A液(50mmol/L醋酸铵,pH5.3)洗脱未结合的组分,之后0%-100%B液(50mmol/L醋酸铵,0.5mol/LNaCl,pH5.3)进行线性梯度洗脱,收集各穿透峰及洗脱峰。分别测定各个峰组分的磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验,用SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1具有酶活性,是导致实验动物偏瘫、呼吸衰竭的致死组分,为磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析显示,P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1纯度很高,接近单一条带,分子量在14kDa左右。2.生物学活性初步检测：(1)酶活性：采用人工合成底物4-硝基-3-苯甲酸(NOB)测得P3-2-1的酶活力为352nmol/minmg, Vmax为7.21nmol/min,最适温度为35℃,最适pH为8.0,且依赖于Ca2+。(2)间接溶血活性：采用红细胞血红蛋白释放法测定P3-2-1组分的间接溶血活性,1%Triton X-100为阳性对照、等体积的Tris-HCl为阴性对照,结果表明P3-2-1组分具有一定的溶血活性,溶血率为21%。(3)肌肉毒性：采用CK肌酸激酶试剂盒测定中毒小鼠血清肌酸激酶(CK)的酶活力。小鼠肌肉注射P3-2-1组分后,2h、4h、6h、8h与Oh组相比,CK酶活力均显著升高,注射2h后酶活力达到最大值。(4)抑菌活性：粗毒为阳性对照,无菌去离子水为阴性对照,检测P3-2-1组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效应,结果显示P3-2-1可显著地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,说明P3-2-1具有抑菌活性。结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术,成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素,分子量为14kDa,最适温度为35℃,最适pH为8.0,依赖于Ca2+,具有间接溶血活性、肌肉毒性及抑菌活性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。