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原发性肝细胞癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年大约有125万新发病例,其中有约50%集中在我国。肝癌肝内血行转移发生最早,也比较常见。癌细胞可侵犯门静脉并形成细小癌栓,癌栓脱落后可在肝内和其他部位形成多发性转移病灶。外科手术只是切除肝癌及周围组织,但是对于小的卫星灶及癌栓,外科手术却是无能为力的。对于化疗来说,由于大多数肝癌细胞对化疗药物不敏感,增加化疗药物的剂量会造成患者全身的毒副作用,引发多器官功能衰竭。同样由于肝癌细胞对放疗不敏感,所以放疗在肝癌治疗中有很大的局限性。另外,有资料研究表明肝癌细胞在联合放化疗后,其侵袭能力有所增加。同时由于肝脏是人体重要的代谢及免疫器官,在手术,药物和放射线的共同损伤作用下,肝脏代谢及免疫功能大幅下降,这也是肝癌患者在治疗后病情迅速恶化的一个重要的原因。因此,肝癌的基因治疗是近年来研究的热点。基因疗法表现为很强的靶向性和杀伤特异性。分子生物学和免疫学的发展为肝癌的基因治疗研究提供了新的理论依据和技术方法。如果有抑癌基因不仅能促进肿瘤细胞的增长抑制和凋亡,而且能引导强烈的旁路抗肿瘤效应(抵消低转导效应),协同放大其他的治疗方案(放化疗和/或抗体基础治疗),放大免疫过程(进一步强烈的提高对肿瘤细胞的损伤);并且有抗血管生成的作用(抑制肿瘤的血液供应和转移)。这样一种抑癌基因可以有效杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞无影响。所以寻找这种能全方位的抑制和杀死肝癌细胞的特异基因一直是近年研究的热门课题。MDA-7/IL-24正是这样一个基因,1993年美国哥伦比亚大学Pual.B.Fisher教授利用亚减法于从黑色素瘤细胞中经人IFN-β和MEZ(mezerin, PKC激活剂)诱生而获得的。后来根据其生物学特性和染色体部位被命名为被命名为MDA-7/IL-24。最初的研究发现该基因在黑色素细胞中高表达而表达量与黑色素瘤细胞恶性度呈现负相关,将该基因转染入恶性的黑色素瘤细胞后发现它具有强烈的生长阻滞、促进分化和促凋亡作用,甚至一定程度上可以逆转黑色素瘤的恶性分化。随后的研究发现,该基因不仅能引起黑色素瘤细胞生长抑制,而且能促进其他各种癌细胞的生长抑制和凋亡,包括黑色素瘤,肺癌,乳癌,胰腺癌,胶质瘤,卵巢癌和前列腺癌等。相对于p53等抑癌基因来说,MDA-7/IL-24抑制癌细胞的增长与这些癌细胞中其它抑癌基因的状态无关(p53, Rb,或p16ink4),因而能更有效的应用于肿瘤的治疗。而且,MDA-7/IL-24基因可以诱导肿瘤细胞发生凋亡,但是对正常分化的细胞却没有细胞毒作用,从而提示该基因有很强的肿瘤选择特异性。MDA-7/IL-24作为一种理想的抑癌基因,目前,国内外对于其在肝癌细胞的生物学作用中的研究较少。本课题课题拟从构建携带MDA-7/IL-24的腺病毒真核表达载体出发,研究MDA-7/IL-24对肝癌细胞系的致凋亡和增殖阻滞作用;并研究其异位表达MDA-7/IL-24基因的肝癌细胞系在生长、运动及迁移能力方面的变化;观察化疗药物阿霉素,顺铂,5-FU和Ad.mda-7联合作用下,肝癌细胞系对药物耐受性的改变;此外,并进一步阐明MDA-7/IL-24作用于肝癌细胞系的主要的细胞信号通路,为肝癌的基因治疗提供一个有效的分子靶。第一部分:携带MDA-7/IL-24基因的腺病毒真核表达载体的构建及表达鉴定目的:构建携带MDA-7/IL-24基因的腺病毒真核表达载体。方法:将人MDA-7/IL-24 cDNAAZ定向克隆于腺病毒穿梭质粒pSGCMV,获得重组质粒pSGCMV- MDA-7,使用脂质体转染法将其与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,通过细胞内同原重组,生成携带MDA-7/IL-24基因的腺病毒真核表达载体。结果:通过DNA测序和RT-PCR提示携带DA-7/IL-24基因的腺病毒真核表达载体构建成功。结论:成功构建携带DA-7/IL-24基因的腺病毒真核表达载体(Ad.mda-7)。第二部分Ad.mda-7选择性杀伤肝癌细胞的体外研究目的:观察感染MDA-7/IL-24前后肝细胞系和肝癌细胞系的生长变化,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法:用Ad.mda-7感染LO2和HepG2,SMMC7721,Hep3B,通过MTT方法观察细胞生长的变化及PI单染法研究Ad.mda-7感染肝癌细胞后细胞周期及凋亡的特点。通过TUNNEL法检测肝癌细胞系凋亡时细胞形态的变化。使用化疗药物(单独和联合Ad.mda-7)作用于LO2和HepG2,通过MTT法观察化疗药物对肝癌细胞的生长抑制作用的变化。结果:1. MDA-7/IL-24基因在肝细胞系和肝癌细胞系中不表达。Ad.mda-7转染LO2和HepG2,SMMC7721,Hep3B后,MDA-7/IL-24基因及蛋白高表达。Ad.mda-7可以诱导肝癌细胞系发生凋亡,并对LO2细胞没有细胞毒作用,其凋亡作用与Ad.mda-7病毒的剂量成正相关。Ad.mda-7可以使肝癌细胞生长阻滞于G2/M期。2. Ad.mda-7可以提高阿霉素,CDDP, 5-FU对肝癌细胞系的杀伤作用,对LO2的作用不明显。结论:Ad.mda-7可以使肝癌细胞产生凋亡和细胞增殖阻滞作用,并对LO2细胞没有明显细胞毒作用。Ad.mda-7可以增加化疗药物对肝癌细胞的杀伤作用,并且使肝癌细胞产生生长抑制。并且,Ad.mda-7能明显降低肝癌细胞系的运动和侵袭能力。第三部分Ad.mda-7作用于肝癌细胞系特异的细胞信号通路蛋白目的:观察Ad.mda-7感染肝细胞和肝癌细胞后,stat-3蛋白在Ad.mda-7感染肝细胞和肝癌细胞后诱导细胞凋亡作用的细胞信号蛋白。方法:使用Ad.mda-7和Ad.vec分别感染肝细胞和肝癌细胞,在12h,24h,36h,48h分别提取细胞胞浆蛋白。使用western blot检测stat-3和stat-3和p-stat-3蛋白在个时间点的变化。并结合MTT实验说明在酪氨酸激酶抑制剂AG490的作用下,在抑制stat-3磷酸化的作用下,Ad.mda-7对肝癌细胞致凋亡作用的变化。结果:Ad.mda-7感染肝癌细胞系后24h,肝癌细胞系胞浆stat-3蛋白生成P-stat3达高峰,与细胞凋亡并不一致。使用AG490抑制stat-3蛋白的磷酸化。可以有效地抑制Ad.mda-7对肝癌细胞系的致凋亡作用,并能改变MDA-7/IL-24基因对肝癌细胞系迁移和运动能力的影响。结论:Ad.mda-7感染肝癌细胞后, Ad.mda-7可以上调肝癌细胞系胞浆stat-3蛋白的活性,抑制P-stat-3蛋白活性可以明显降低Ad.mda-7对肝癌细胞的抑制作用。