【摘 要】
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肝素是一种多糖类物质,是被广泛使用的抗凝血药物。3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS:3’-Phosphoadenosine-5’-phosphosulfate,)是肝素酶法合成过程中酶的辅因子和硫酸基团
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肝素是一种多糖类物质,是被广泛使用的抗凝血药物。3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸(PAPS:3’-Phosphoadenosine-5’-phosphosulfate,)是肝素酶法合成过程中酶的辅因子和硫酸基团供体。之前,已有研究用大肠杆菌表达几种粗酶来合成PAPS,这种粗酶合成体系以三磷酸腺苷(ATP:adenosine thiphosphate)为底物,包括三种粗酶以及第四种未知酶。第四种未知酶的作用是降解PAPS合成过程中的副产物二磷酸腺苷(ADP:adenosine diphosphate) 。为了探究体外酶法合成PAPS的方法,我们对第四种未知酶做了研究并且建立了一种体外酶法合成PAPS的方法。在本研究中,我们明确第四种未知酶是Nudix水解酶NudJ,并且我们将NudJ加入PAPS的合成体系中,ADP被降解为单磷酸腺苷(AMP:adenosine diphosphate)。本文以大肠杆菌BL21为宿主菌,分别表达三磷酸腺苷硫酸化酶(KAST:adenosine triphosphate sulfurylase,)、5’-磷酸腺苷激酶、(APSK:adenosine-5’-phosphosulfate kinase,、焦磷酸酶(PPA:pyrophosphatase)和Nudix水解酶NudJ四种酶。我们研究得出10mM ADP可被NudJ在15mmin内完全水解为AMP,并且在ADP和ATP同时存在时NudJ优先水解ADP。除此之外,NudJ对PAPS无水解作用。NudJ的加入使PAPS合成中的副产物ADP水解为AMP,将两个保留时间相近的物质(ADP和PAPS)分开,简化后期的色谱纯化过程。这种酶法体外合成PAPS的方法对肝素的酶法合成有重要意义。
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