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术后疼痛(postoperative pain)又称急性伤害性疼痛,不同于一般的生理性疼痛,是手术后即刻发生的急性疼痛(通常持续时间不超过7d),是临床最常见和最需紧急处理的急性疼痛。文献报道75％以上的患者术后承受不同程度的疼痛,将导致机体病理生理的改变,产生一系列不良反应,如心率加快、心脏负荷增加、呼吸浅快、胃肠蠕动减慢、免疫功能下降等,严重影响患者术后的治疗和生活质量。目前,对术后疼痛的机制研究主要集中在外周和中枢敏化上,众多研究表明,炎症因子与术后疼痛关系密切,如炎症因子IL-1βIL-6、TNF-α等能引起中枢或外周敏化,在术后急性疼痛的发生发展中发挥重要作用。Toll样受体4(Tolllike Receptor4,TLR4)是Toll样受体家族重要成员之一,广泛表达于各细胞系,在中枢神经系统,主要表达于小胶质细胞和星形胶质细胞,是联系天然免疫和后天免疫的桥梁。TLR4识别外源性配体如脂多糖(LPS)或内源性配体如热休克蛋白(HSP)后被激活,通过髓样分化因子88(Myeloid differentiation factorMyD88)依赖性途径或MyD88非依赖性途径,进而介导炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的大量合成与释放,引发炎症反应。Tanga、Wadachi、Raghavendra等在神经病理性疼痛、炎性疼痛模型中研究发现,位于脊髓胶质细胞上的TLR4及下游细胞因子升高,其介导的炎症反应在痛觉信号传导过程中发挥关键作用,但其在术后急性疼痛模型中的作用尚未见报道。在手术创伤和应激条件下,TLR4可识别内源性损伤相关分子(DAMPs),如高迁移率簇蛋白1、热休克蛋白、细胞外基质分解产物等内源性配体,促进细胞因子的合成与释放,引发无菌性炎症反应,但围术期这种无菌性免疫炎症反应是否参与了术后疼痛的形成与发展尚不清楚。在术后疼痛模型中,研究发现脊髓胶质细胞被激活,主要是由于伤害性信号沿初级传入纤维至脊髓背角引起,在该神经传导通路中TLR4是否被激活并不清楚。本研究首次提出了TLR4介导的炎症反应参与了术后疼痛的发生发展这一假设。
目的：采用大鼠切口痛模型,观察脊髓水平TLR4mRNA及炎性细胞因子IL-1βmRNA、TNF-amRNA表达的变化,探讨TLR4信号转导通路在术后疼痛中的作用,从而为术后急性疼痛的治疗寻找新靶点。
方法：⑴健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠58只,体重180-220g,由郑州大学实验动物中心提供。⑵按照Brennan等提出的方法建立大鼠切口痛模型,吸入2%异氟醚麻醉后,在大鼠左后爪从足底近端0.5 cm处向趾部作长约1cm纵行切口,深及皮下筋膜,然后用眼科镊挑起足底肌肉并做纵向切割,但保持肌肉的起止及附着点的完整性,按压止血后,用5-0尼龙线缝合皮肤两针,手术切口处给予碘伏消毒并覆盖抗生素软膏,即完成模型制备。行为学检测:分别在手术前0h、术后0.5h、1h、2h、8h、12h、1d、2d、3d、5d、7d应用电子von Frey测定大鼠手术侧和非手术侧的机械缩足反应阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)。⑶生化检测:分别在手术前0h、术后2h、8h、1d、2d、3d、5d、7d各取6只大鼠取腰段脊髓(L4-6),采用荧光定量PCR(Real-Time PCR)方法检测脊髓TLR4mRNA、IL-1βmRNA、TNF-amRNA的表达。
结果：①切口痛大鼠机械缩足反应阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)的变化。所有大鼠术前左右脚MWT基础值无明显差异,手术侧(左脚)术后0.5h开始下降,在2h时下降最显著,与术前和非手术侧(右脚)MWT相比,均有统计学差异(P＜0.05),术后7天MWT基本恢复到基础值。非手术侧在各时间点MWT均无统计学差异(P＞0.05)。②切口痛大鼠脊髓水平TLR4mRNA的变化。术前大鼠脊髓中即有少量TLR4 mRNA表达,手术刺激后8h(2.79±0.57)、1d(4.51±0.54)、2d(1.66±0.31)TLR4 mRNA表达明显上调,与术前相比有统计学差异(P＜0.05),在术后8h-1d表达较高,在术后1d达最高水平,而后逐渐减少,直到术后3d,与术前相比,无统计学差异(P＞0.05)。③切口痛大鼠脊髓水平IL-1βmRNA的变化。IL-1βmRNA手术刺激后2h(2.33±0.61)开始升高,到术后8h(2.82±1.09)一直处于较高水平,与术前及术后各时间点相比,有统计学差异(P＜0.05),而后逐渐减少,在术后3d表达基本恢复到术前水平。④切口痛大鼠脊髓水平TNF-αmRNA的变化。TNF-α在手术刺激后2h(1.96±0.41)开始升高,在术后2h、8h(4.48±1.24)、1d(2.40±0.40)、2d(1.75±0.40)与术前相比有统计学差异(P＜0.05),在术后8h达最高水平,而后逐渐减少,直到术后3d,与术前相比,无统计学差异(P＞0.05)。⑤TLR4mRNA与切口痛大鼠机械缩足反应阈值(mechanical withdrawalthreshold,MWT)的相关性。相关系数r=-0.484,P＜0.05,两者中度相关。⑥TLR4mRNA与IL-1mRNA变化关系的相关性。相关系数r=0.294,P＜0.05,两者的变化情况呈低度相关。⑦TLR4mRNA与TNF-αmRNA变化关系的相关性。相关系数r=0.540,P＜0.05,两者的变化情况呈低度相关。
结论：⑴大鼠切口痛模型中,术后脊髓TLR4mRNA及炎性细胞因子IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表达升高。⑵TLR4与术后疼痛呈中度相关,其信号转导通路可能参与了术后疼痛的形成与发展。