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目的：采用Taqman探针技术,建立荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测端粒酶hTERT mENA的方法,对前列腺癌患者组织和尿液中端粒酶hTEIRTmRNA进行定量检测并对其临床应用进行评价.
方法：1.根据端粒酶hTERT mRNA全序列(NM198253),在端粒酶hTERT基因的外显子2和3之间设计一对引物和一条Taqman探针,优化反应体系,建立端粒酶hTERT mRNA的FQ-RT-PCR方法.2.用pMD18-T载体与普通PCR扩增所得的端粒酶hTERT cDNA片段进行连接,构建重组质粒作为标准品,将标准品10倍倍比稀释后进行荧光定量PCR扩增,以拷贝数的自然对数为横坐标,循环域值(Ct)为纵坐标制作标准曲线.3.对本方法进行方法学评价,包括探针稳定性、灵敏度、特异度和精密度等等.4.用荧光定量RT-PCR对26例前列腺癌患者(PCa)组织和30例前列腺增生患者(BPH)组织,18例前列腺癌患者(PCa)的尿液和27例前列腺增生患者(BPH)的尿液标本,分别检测端粒酶hTERT mRNA含量并进行临床应用评价.结果1.成功建立了实时荧光定量RT-PCR检测端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法灵敏度高,可达10 copies/reaction,线形范围广,达10～1×10<8>copies/reaction,重复性好,批内CV:1.25﹪～2.06﹪,批间CV:3.32﹪～4.59﹪,Ct值与拷贝数之间具有良好的线性关系,相关系数为0.997.扩增产物克隆和测序分析显示本扩增片段为端粒酶hTERT特异性片段.2.30例良性前列腺增生(BPH)组织中端粒酶均未检测到hTERT mRNA的表达,而26例前列腺癌(PCa.)组织中有19例检出(73.0﹪)hTERT mRNA表达阳性,PCa组含量(hTERT mRNA/GAPDHmRNA×10<5>):9.64(0.00～20.81).hTERT mRNA在PCa组织中表达量显著高于BPH组织(P<0.01).ROC曲线分析结果显示ROC-AUC=0.865(95﹪Cl:0.758～0.973),当hTERT mRNA/GAPDH mRNA×10<5>截断值为0.875时,其敏感度达73.0﹪、特异度100﹪.从表达趋势上看端粒酶hTERTmRNA在病理分化程度越差表达量越高,但尚不具有统计学意义(P>0.05),在不同临床分期表达量也不具有统计学意义(P>0.05).3.在前列腺穿刺活检前共收集18例前列腺癌(PCa)和27例前列腺增生(BPH)患者前列腺按摩后的尿液.由于尿沉渣中不仅含有PCa细胞和非前列腺细胞,还含有其它脱落细胞如膀胱上皮细胞、肾小管细胞、尿道上皮细胞等,所以不能用管家基因校正前列腺细胞数,PSA mRNA在正常前列腺细胞中表达相对恒定,在PCa细胞中的表达有轻度下降(～1.5倍),所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺细胞(PSAmRNA的检测方法学已建立),尿液PSA mRNA表达呈阳性(Ct值<37个循环)的标本才被认为含有足够的前列腺细胞,方可用于端粒酶hTERT、mTNA的检测.尿液端粒酶hTERT mRNA含量以端粒酶hTERT mRNA/PSA mRNA的比值乘以10<4>来表示。
结果：PCa组(medianO,rarlge:0～0.728),BPH组(median,0;range:0～0)表达均为阴性,两者相比具有显著性差异(U=180.0,W=558.0,Z=-2.19,P<0.05).尿液端粒酶hTERT、mRNA的阳性率与临床分期和病理分级无关.分析实验结果显示,ROC曲线下面积(AUC-ROC)=0.630:(95﹪CI:0.456～0.803), 18例癌标本中有6例检出hTERT mRNA阳性,27例BPH组中2例检出阳性,其检测敏感度达33.3﹪,特异度92.6﹪,阳性预测值(PPV)75.0﹪,阴性预测值(NPV)67.5﹪,虽敏感度不高,但有很高的特异度.临床最常用筛查PCa的指标是血清PSA,虽有较高的敏感度,但特异度不高,在非恶性前列腺疾病时也会升高,而尿液hTERTmRNA敏感度低,但特异度高,在PCa筛查时可以将两者相结合,进一步提高诊断效能.
结论：1.成功建立了荧光实时定量逆转录聚合酶链反应检测端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法具有敏感、特异、准确、高效、重复性好、结果数据化等特点.2.PCa组织中端粒酶hTERTmTNA特异性高表达,为端粒酶hTERr.mRNA成为PCa诊断和监测指标提供了理论依据.3.尿液端粒酶h17ERT mRNA用于PCa诊断较血清PSA存在敏感度不高,但有更高的特异性,在PCa筛查时可以将尿液端粒酶hTERT mRNA和血清PSAmRNA两者相结合,进一步提高诊断效能.