体外诱导人羊膜间充质干细胞向胆管上皮细胞分化的实验研究

• 作 者: 岳红双
• 出 处: 遵义医学院
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 人羊膜间充质干细胞 肝干细胞 胆管上皮细胞

目的:探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)的间充质干细胞特性,以及在体外经诱导后能否向胆管上皮细胞分化,为胆管生物工程奠定基础。方法:1)取足月剖宫产胎盘羊膜组织,用酶消化法分离出人羊膜间充质干细胞,取第3代细胞进行流式细胞术检测鉴定h AMSCs表型特征,免疫荧光染色检测hAMSCs波形蛋白和CK-19的表达,在体外经诱导向成骨、成脂肪细胞分化。2)将h AMSCs体外定向分化为肝干细胞:将第3代h AMSCs接种于6孔板加入含肝细胞生长因子的LG-DMEM培养基诱导分化,观察细胞生长分化形态,细胞出现圆形、卵圆形或多角形改变后,收集细胞培养液进行生化检测碱性磷酸酶、甲胎蛋白及白蛋白含量。3)诱导肝干细胞向胆管上皮细胞分化:向上述诱导后的细胞6孔板内,加入含干细胞因子、肝细胞生长因子、表皮生长因子的LG-DMEM培养液,观察细胞生长及分化情况,出现胆管内皮细胞典型形态时,通过免疫荧光染色检测细胞角蛋白CK19的表达,以及实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测细胞CK19 m RNA的表达,对分化完成的细胞加以鉴定。结果:h AMSCs贴壁生长,传代后细胞呈长梭形,且旋涡状排列,流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型,表达波形蛋白,不表达CK-19,且可向成骨、成脂肪分化。诱导2周后倒差显微镜观察到细胞呈现典型卵圆形或多角形肝干细胞形态,并呈不典型巢状排列。与诱导前比较,诱导后细胞培养液中肝干细胞标记物甲胎蛋白、白蛋白较诱导前升高,差异有统计学意义(p<0.01),而间充质干细胞标记物碱性磷酸酶降低,差异有统计学意义(p<0.01);细胞继续定向诱导分化3周后,细胞呈现典型树枝状胆管内皮细胞形态学改变,诱导后的细胞免表达CK19及CK19 m RNA表达上调。结论:人羊膜间充质干细胞具有间充质干细胞特性,具有多向分化潜能,在体外经诱导能定向分化为胆管上皮细胞,可作为胆管生物工程细胞潜在来源。