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本实验室之前分别报道了嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomna maltophilia)可共代谢降解烟碱类农药吡虫啉(IMI)、啶虫咪(AAP)、噻虫啉(THI)。但我们在预实验中发现,添加不同的共代谢基质到嗜麦芽寡养单胞菌转化液中,会产生不同的吡虫啉代谢产物,说明共代谢基质的不同会导致菌体启动不同的吡虫啉降解途径。因而需要进一步采用分子生物学方法敲除共代谢途径的某些关键酶,构建嗜麦芽寡养单胞菌突变株,以研究不同的共代谢基质进入的代谢途径及其与不同的吡虫啉降解产物的关系,从而阐明共代谢基质调控吡虫啉代谢途径的分子机制。研究发现,嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)R551-3菌株具有氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、安普霉素和链霉素等多种常用抗生素的抗性,因而难以采用上述抗生素抗性作为遗传转化的筛选标记。本文先后尝试采用十二烷基磺酸钠(SDS)法、紫外法、高温法、高温.SDS法等消除嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)R551-3的抗生素抗性,均未获得成功。最后采用电穿孔法成功地消除该菌的四环素抗性,为进一步开展参与吡虫啉共代谢的关键基因的敲除和回补奠定了基础。基于嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)R551-3的全基因组序列信息,成功的克隆到6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PH)、6-磷酸果糖激酶(FPK)上下各1000bp左右的同源臂片段,并从Pecbac1质粒上克隆到了氯霉素抗性基因,并构建出了6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸果糖激酶的同源双交换质粒:pEX100Tlink+(G6PH-up)+Cm+(G6PH-down)、pEX100Tlink+(G6PH-up)+(pro-Cm)+(G6PH-down)、pEX100Tlink+(FPK-up)+Cm+(FPK-down)和pEX100Tlink+(FPK-up)+(pro-Cm)+(FPK-down)。为进一步的关键酶的基因敲除研究工作奠定了基础。
6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶是吡啶衍生物中重要的合成烟碱类杀虫剂的中间体,化学合成困难。本实验室先后报道了Comamonas testosteroni JA1可以转化烟酸和3-氰基吡啶生成6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶,而Pseudomonasputida KT2440只能转化烟酸生成6-羟基烟酸,而其转化的本质都是烟酸脱氢酶(NaDH)的催化,已通过亚基的置换实验,初步确定了JA1菌株的NaDHS蛋白亚基决定了3一氰基吡啶羟基化功能。基于以上背景,本文试图探讨NaDH功能域(结构)与底物特异性(功能)之间的关系。通过NCBI(pprotein-blast)工具对NaDHKT2440和NaDHJA1两个蛋白的每一个功能域进行了比较,找到了两者之间的差异;接着又对S亚基中哪些氨基酸决定了3-氰基吡啶的羟基化功能进行了分析。经过一系列氨基酸置换和NCBI(protein-blast)工具的分析,找到了NaDHKT2440及NaDHJA1 S亚基中可能的决定底物特异性的氨基酸。即当将NaDHJA1 S亚基中23(Y)和29(M)置换成NaDHKT2440 S亚基中23(L)和29(L)后,NaDHJA1 S亚基中原有的Ⅰ型[2Fe-2S]结构域消失,与NCBI对NaDHKT2440结构域的分析相同。同样,当将NaDHKT2440 S亚基中26(L)和27(Ⅰ)置换成NaDHJA1 S亚基中26(Y)和27(V)后,NaDHKT2440 S亚基中出现了原来没有的Ⅰ型[2Fe-2S]结构域,与NCBI对NaDHJA1结构域的分析相同。根据这一分析结果,设计了定点突变实验,通过overlap PCR构建了突变的表达质粒,HPLC测定酶活,但结果显示突变前后烟酸脱氢酶NaDHKT2440和NaDHJA1活性并无改变,并未出现预计的结果。