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目的:探讨纤维蛋白支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖的影响;评价纤维蛋白支架在神经组织内的生物相容性,观察支架在体内的改建过程。为纤维蛋白用于构建组织工程支架移植修复脊髓损伤提供可行性研究资料。方法:1.用培养基将纤维蛋白原制成胶状溶液,在新鲜鼠血浆中凝血酶的促凝作用下,使其凝固成多孔的具有三维网状结构的纤维蛋白支架。显微镜观察支架的表面结构,并用电子显微镜观察支架内部的三维结构。2.分别培养胚胎大鼠脊髓来源的神经干细胞和新生鼠脊髓神经胶质细胞,接种于纤维蛋白支架上,同时用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照。于体外培养不同时间(3天、7天、14天)后,用神经丝蛋白(NF200)对神经细胞进行免疫荧光染色,测量各复孔(n=4)内NF阳性细胞的突起长度,计算其平均值;培养14天后,用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对胶质细胞进行染色,各复孔(n=4)内统计5个不同视野的胶质细胞总数和GFAP阳性细胞数,计算GFAP阳性细胞相对数量的平均值。用免疫印迹技术对荧光染色结果进行验证。比较在纤维蛋白支架和玻片上神经干细胞分化、神经纤维延伸及神经胶质细胞增殖的差异,分析支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖影响。3.将纤维蛋白支架植入大鼠脊髓完全横断缺损部位,同时以脊髓完全横断缺损大鼠作为对照组。动物存活不同时间后,取出支架植入部位的组织,应用透射电镜观察支架移植部位的组织学结构及支架在神经组织内的降解和改建过程,评价支架的组织相容性。4.将纤维蛋白支架植入大鼠脊髓完全横断缺损部位,同时以脊髓完全横断缺损大鼠作为对照组。动物存活不同时间后,取出支架/脊髓组织,用免疫荧光双标和免疫印迹技术分析损伤部位/支架移植区的神经纤维再生和胶质纤维增生情况。评价纤维蛋白支架移植对大鼠脊髓损伤后神经再生及胶质瘢痕形成的影响。5.将纤维蛋白支架植入大鼠脊髓完全横断缺损部位,同时以脊髓完全横断缺损大鼠作为对照组。分别于术后4周,8周,12周对各组动物下肢运动功能进行BBB评分。比较各组动物后肢运动功能的恢复程度。评价支架移植用于修复脊髓损伤的效果和临床应用的可行性。结果:1.纤维蛋白支架呈半透明多孔海绵状,质地柔软有弹性。支架纵切面经伊红染色后用光镜观察,支架内部呈多孔的网状结构。用扫描及透射电镜观察支架内部纤维蛋白纤维的纵、横切面,具有三维多孔网状结构。2.于体外培养的各观察时间点,纤维蛋白支架组的NF阳性纤维明显长于对照组(3天和7天组,P＜0.05;14天组,P＜0.01);而各时间点的GFAP的表达水平明显低于对照组(P＜0.05)。体外培养14天后,支架组GFAP细胞阳性率为23.5%,对照组为69.1%,支架组的GFAP阳性星形胶质细胞相对数量明显少于对照组。3.实验组术后12周,仔细分离移植部位粘连的周围组织取出整体脊髓,可见脊髓缺损部位移植支架后已完全愈合,局部组织增生,脊髓外观饱满完整;对照组术后12周,缺损部位有致密的瘢痕增生并与背侧结缔组织粘连,分离周围组织,取出整体脊髓,可见缺损部位大部分已修复,局部有暗红色塌陷区,整体脊髓外观欠饱满。透射电镜观察实验组脊髓支架移植部位和对照组脊髓缺损瘢痕修复部位的超微结构,可见实验组支架内有毛细血管和有髓神经纤维分布;对照组局部组织内存在空洞,空洞内有组织碎片和浆细胞,洞壁细胞排列紧密。4.术后4～12周,支架移植组可见支架内有少量神经纤维,此后神经纤维逐渐增多,而胶质细胞增生不明显;对照组脊髓损伤局部可见坏死空洞,空洞周边胶质细胞增生明显。免疫印迹检测结果显示:术后各时间点,支架移植组神经丝蛋白(NF200)相对含量高于对照组;对照组胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的相对含量高于支架移植组。结果经统计学处理,均具有显著性差异(P＜0.05)。5.术后两组动物的运动功能均有不同程度的恢复,但对照组动物恢复较慢。各观察时间点BBB评分,支架移植组均高于对照组,统计学有显著性差异(P＜0.05)。结论:1.纤维蛋白支架外观半透明具有较好的韧性,可促进神经干细胞向神经细胞分化并有利于神经纤维的延伸而抑制星形胶质细胞的增殖成熟。2.纤维蛋白支架具有三维多孔网状结构。移植入神经组织内则具有可降解性和良好的组织相容性,移植后促进大鼠脊髓损伤后神经再生和神经纤维的延伸而抑制胶质瘢痕形成。3.纤维蛋白支架移植对脊髓损伤动物后肢运动功能的恢复具有一定的促进作用。纤维蛋白作为生物材料用于构建修复脊髓损伤的组织工程支架具有良好的应用前景。