家蚕PHF5A基因的研究

• 作 者: 刘玉生
• 机 构: 浙江理工大学
• 出 处: 浙江理工大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 家蚕 锌指蛋白 亚细胞定位 细胞周期

PHF5A(plant homology domain：finger protein 5A)转录起始因子，它的分布十分广泛，从酵母到人类几乎所有真核生物中都发现了该蛋白，但至今在原核生物中尚未发现此蛋白。它编码110个氨基酸，属于一种高度保守的小转录因子或协因子，缺少了PHF5A，会产生剪接不完全的pre-mRNA。另外PHF5A还与细胞周期密切相关，缺少了PHF5A，有丝分裂终止在G<,2>/M期。我们在对家蚕蛹cDNA文库测序过程中获得了一个类似PHF5A的基因序列，此基因由三个外显子和两个内含子组成，编码110个氨基酸。序列分析发现此基因编码的氨基酸序列与果蝇、人、小鼠、家鼠等物种的PHF5A蛋白同源性都超过了90﹪，因此我们将此蛋白命名为BmPHF5A。推测的蛋白分子量、等电点分别为12.47 kDa和8.4，这也与已知的PHF5A蛋白相似。
将BmPHF5A基因ORF克隆到pGEM-T载体上，构建了重组质粒，经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，插入表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点中，成功构建了表达质粒，并转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR、酶切鉴定以及测序分析重组正确。IPTG诱导表达后裂解菌作SDS-PAGE分析，在16kD处有一条特别浓的条带，与预期值相符，表达量可达菌体总蛋白的40﹪左右。融合蛋白以不溶性的包涵体形式存在，超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤；对包涵体进行溶解和梯度透析复性；采用亲和层析纯化融合蛋白His-BmPHF5A。以该融合蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔制作了该重组蛋白的多克隆抗体，ELISA检测该抗体血清的效价可达到1∶32000。Western印迹实验进一步验证了目的蛋白的表达。在亚细胞定位中，发现该蛋白主要存在于在细胞核中。RNAi显示Bm5细胞在G2/M期的数目增加。