论文部分内容阅读
目的肿瘤可以持续的模拟伤口反应产生慢性炎症,故又被称为永不愈合的伤口。在正常创伤愈合过程的早期阶段,TGF-β和bFGF出现表达上调,促进组织再生。然而在创伤愈合的晚期,TGF-β通路的激活和bFGF通路的下调导致了纤维瘢痕形成。然而,在肿瘤细胞中TGF-β通路的失活和bFGF信号通路的持续激活是导致肿瘤增殖重要因素之一,所以肿瘤不能像正常伤口那样愈合。肿瘤的形成涉及到bFGF通路的持续激活,而组织损伤的修复则是一个自我限制的过程。在伤口愈合末期,组织中充足的TGF-β与不断减少的bFGF导致细胞增殖停止、基质沉积和纤维瘢痕形成。但是,TGF-β1在癌症早期可以抑制肿瘤生长,但在癌症晚期TGF-β1通过诱导细胞发生EMT以及通过与其他的生长因子相互作用促进了肿瘤细胞的增殖和转移。在研究中我们使用TGF-β1与AZD4547合用抑制肝癌细胞中bFGF通路的同时激活TGF-β通路,以探究该调控方式是否能抑制肿瘤生长,是否能促进肿瘤形成纤维瘢痕。方法:1.使用CCK8细胞毒活性实验、台盘蓝排斥实验,检测TGF-β1和AZD4547单独使用及TGF-β1和AZD4547联合使用对肝癌SMMC-7721细胞株和HepG2细胞株细胞增殖的影响。2.利用Transwell实验和伤口愈合实验的方法,检测了TGF-β和AZD4547对SMMC-7721肝癌细胞株和HepG2肝癌细胞株迁移的影响。应用免疫荧光法进一步检测了TGF-β和AZD4547对肝癌细胞迁移相关蛋白的影响,如:E-cadherin和N-cadherin。3.使用流式细胞技术检测了TGF-β1和AZD4547单用以及合用处理后细胞的表型改变情况,检测了成纤维细胞和间质细胞常用的标记物:CD90、CD105、HLA-ABC、CD140b、CD13。4.采用裸鼠肝癌细胞株(HepG2)皮下移植瘤,检测TGF-β1和AZD4547单用以及合用对肝癌细胞株的体内移植瘤的抑制作用,应用PCNA免疫组化检测TGF-β1和AZD4547对移植瘤增殖的影响。5.使用免疫组化和胶原纤维染色的方法,检测了TGF-β1和AZD4547加药之后移植瘤组织切片的纤维化程度和成纤维细胞标记物的表达情况。6.对TGF-β1和AZD4547诱导后的SMMC-7721细胞进行转录组基因测序,以探究药物对细胞功能改变的影响,并将药物诱导转分化后的肝癌细胞转录组基因与正常的成纤维细胞转录组基因进行比较。7.通过总结基因测序结果,进行生物信息学分析,之后对诱导肝癌细胞转分化相关通路蛋白进行实验验证,使用Western blot验证TGF-β通路中蛋白表达情况,寻找可能与诱导分化和肿瘤抑制作用密切相关的通路蛋白。结果:1.在体外实验中TGF-β1与AZD4547合用能够明显抑制肝癌细胞的增殖和迁移。TGF-β1与AZD4547合用对肝癌细胞的抑制作用比单用AZD4547强。2.TGF-β1与AZD4547合用对体内肝癌细胞异种移植瘤的抑制作用(抑瘤率为55%)优于单独的AZD4547(抑瘤率为35%)。3.体内实验中,TGF-β1和AZD4547联合加药在抑制肿瘤生长的同时可以促进肿瘤组织发生纤维化。4.细胞实验发现,TGF-β1和AZD4547联合使用可以诱导肝癌细胞形态变为长梭形,并且促进肝癌细胞中波形蛋白、I型胶原蛋白和纤维连接蛋白的表达。5.TGF-b1与AZD4547联合使用可以明显改变肿瘤细胞的表型,促进肝癌细胞表达间质细胞标记物CD90、CD105、CD140B、CD13、HLA-ABC。6.基因测序结果证实,TGF-β1和AZD4547诱导分化后的细胞与原肝癌细胞基因表达存在明显差异。加药诱导后肿瘤细胞中的肝癌特异性基因表达下降,诱导后肿瘤细胞中的成纤维细胞相关基因表达升高,诱导后的基因表达变化更接近于成纤维细胞。7.研究发现,TGF-β1与AZD4547联合使用后,能够在维持肝癌细胞中p-Smad3的水平同时降低p-Erk的水平,说明Smad通路在该诱导分化过程中具有重要作用。8.使用其他FGFR阻滞剂也能取得相同的生长抑制和诱导分化效果。使用FGFR抑制剂(BGJ398)和MEK抑制剂(PD98059)代替AZD4547与TGF-β1合用仍然可以观察到肿瘤细胞的形态学改变和Vim和COL I的表达增加。结论:联合使用TGF-β1与AZD4547可以诱导肝癌细胞转向正常纤维细胞方向分化,分化后细胞的形态、分子表型、功能蛋白和基因表达均类似于正常成纤维细胞。体内实验表明,TGF-β1联合AZD4547不仅能抑制肿瘤的生长,而且促进了肿瘤实质纤维化。Smad3蛋白的磷酸化升高和Erk蛋白的磷酸化降低是TGF-β1联合AZD4547诱导肝癌细胞转分化的关键过程,单用TGF-b1或AZD4547都无法完成该诱导分化过程。我们的研究结果表明,FGFR抑制剂将TGF-β在肝癌细胞中的肿瘤促进作用转变为肿瘤抑制作用,并且诱导肿瘤细胞表达成纤维细胞相关基因。体内外实验结果证明TGF-β1联合AZD4547对肿瘤生长的抑制作用强于靶向药物AZD4547单独作用。本研究为肝癌的转化研究和多靶点的肿瘤靶点治疗研究提供了一种新的策略。