论文部分内容阅读
缩泉丸出自《妇人良方》,由盐益智仁、乌药、山药组成。方中君药益智仁炮制品的选择是影响其临床疗效的关键,因益智仁生品主入脾经,主治脾虚而不能统摄涎唾的口涎自流;益智仁盐炙后主入肾经,主治肾虚小便清长,夜尿频多或遗尿。在国家十一五科技支撑和自然科学基金面上项目的支持下,课题组多层次多角度阐明了益智仁“生品入脾·止泻,盐炙入肾·缩尿”中药炮制理论的科学内涵。本课题在前期益智仁“盐炙入肾”的研究基础上,从复方角度出发,以缩泉丸“补肾缩尿”的功效为切入点,研究缩泉丸中益智仁盐炙的科学性和“盐炙入肾-肾主水”的作用机理。目的本课题为国家自然科学基金面上项目“基于益智仁盐炙前后及分别组成缩泉丸来研究‘盐炙入肾-肾主水’的机制”（81473353）的一部分,对缩泉丸中益智仁盐炙科学性和“盐炙入肾-肾主水”作用机理进行研究。课题组前期已初步确定了缩泉丸的药效部位及炮制前后物质基础的差异。本文在前期研究的基础上,通过比较益智仁盐炙前后组成的缩泉丸对肾阳虚多尿模型大鼠肾和膀胱功能及机体水液代谢的改善作用的差异,体内药动学过程的差异等探讨缩泉丸中益智仁盐炙的科学性及“盐炙入肾-肾主水”的作用机理。方法采用文献学、药理学和化学相结合的手段开展益智仁盐炙前后组成缩泉丸研究“盐炙入肾-肾主水”作用机理。1进行文献研究,整理古方缩泉丸主治病症、缩泉丸中益智仁和全方的研究进展、“盐炙入肾”研究进展、“肾主水”研究进展等内容,为开展益智仁盐炙缩泉丸增强“盐炙入肾-肾主水”作用的机理研究提供理论依据。2采用药理学方法,建立两种大鼠多尿模型,验证缩泉丸温肾缩尿的药理作用,并比较盐炙前后作用差异。3运用ELISA（酶联免疫检测）测定益智仁盐炙前后组成的缩泉丸血中β2-微球蛋白（β2-MG）、白细胞介素Ⅱ（IL-2）、血清免疫球蛋白G（IgG）含量;HE染色法测定肾脏、睾丸、胸腺、脾脏的病理形态。从益智仁盐炙前后组成的缩泉丸对模型大鼠肾脏和睾丸病理形态、肾功能、免疫功能三个方面的影响,探讨缩泉丸中益智仁盐炙对于肾脏的影响,阐明缩泉丸中益智仁“盐炙入肾”的作用机理。4从分子水平出发,运用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法（WB）等方法比较益智仁盐炙前后组成的缩泉丸对模型大鼠肾脏水通道蛋白-2（AQP-2）mRNA及蛋白的表达;离体膀胱逼尿肌细胞M3R和β3-AR mRNA及蛋白的表达以及对HPA轴的影响,从益智仁盐炙前后组成的缩泉丸对机体水液代谢的影响,阐明缩泉丸中益智仁盐炙“肾主水”的作用机理。5从药代动力学出发,运用在体单向肠灌流实验研究缩泉丸有效部位圆柚酮（NK）和乌药醚内酯（LD）的肠吸收特征及炮制对肠吸收的影响,阐明益智仁盐炙前后组成缩泉丸肠吸收的变化。运用HPLC-QQQ-MS测定血液中杨芽黄素（TC）、白杨素（CS）、11,12-二羟基圆柚酮（DNK）、LD、NK的含量;同时测定尿液和粪便中LD、DNK和NK的含量。通过对药物在体内的代谢特征,以及对于粪便、尿液的排泄影响,比较益智仁盐炙前后组成缩泉丸代谢差异,阐明益智仁盐炙对于缩泉丸主要药效成分在体内动态变化规律的影响。结果1缩泉丸石油醚部位能显著延长首次排尿时间（P<0.05）;显著降低ACH激动的豚鼠膀胱逼1对水负荷多尿模型大鼠,与模型组相比,各给药组能够延长水负荷模型大鼠首次排尿时间（P<0.05）,但总排泄率无显著性差异（P>0.05）;对肾阳虚多尿模型大鼠,与模型组相比,给药后尿量显著减少（P<0.05）。表明缩泉丸具有―缩尿‖作用,且缩泉丸中君药益智仁盐炙后作用有增强的趋势。2缩泉丸对肾阳虚多尿模型大鼠肾脏、睾丸指数的改变均有显著抑制作用（P<0.05）,对肾脏和睾丸病理损伤有显著的改善（P<0.05）,并且显著降低血清中BUN、β2-MG含量（P<0.05）,IL-2、IGg含量（P<0.05）,且益智仁盐炙后组成的缩泉丸作用增强,从大鼠肾脏和睾丸病理形态、肾功能、免疫功能三个方面的影响阐明缩泉丸中益智仁“盐炙入肾”作用机理。3缩泉丸上调肾阳虚多尿模型大鼠肾脏AQP-2 mRNA和蛋白的表达（P<0.05）;调整M3、β3-AR mRNA和蛋白表达（P<0.05）使膀胱保持正常的收缩和舒张功能;显著升高CRH、ATCH和cAMP浓度（P<0.05）,从而调整尿液的生成,且益智仁盐炙后组成的缩泉丸作用增强,从机体水液代谢的影响阐明缩泉丸中益智仁盐炙“肾主水”的作用机理。4缩泉丸石油醚部位中NK、LD在各肠段吸收均较好;与益智仁生品缩泉丸相比,益智仁盐炙缩泉丸中圆柚酮Ka和Peff增大（P<0.05）;乌药醚内酯的Peff增大（P<0.05）,从吸收角度阐明盐炙科学性。5益智仁盐炙缩泉丸主要入血成分DNK、NK在血中的半衰期(t1/2)、血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)、体内平均滞留时间（MRT）显著高于益智仁生品缩泉丸（P<0.05）,而消除率（CL）显著低于益智仁生品缩泉丸（P<0.05）;LD在血中的CL、MRT药动学参数与益智仁生品缩泉丸相比也有显著性差异（P<0.05）;益智仁盐炙后组成的缩泉丸生物利用度均有不同程度增加,从体内变化角度阐明盐炙科学性。结论1益智仁盐炙后组成的缩泉丸其缩尿作用增强,是通过改善肾脏和睾丸病理损伤,改善肾功能,提高免疫功能,三个方面增强药物“补肾”作用的,从药物盐炙增强“补肾”作用方面阐释了中药炮制理论“盐炙入肾”的作用机理。2肾脏主持和调节一身水液,盐炙后补肾作用增强,可以调节机体的水液代谢平衡,益智仁盐炙后组成的缩泉丸增强水液代谢平衡是通过提高肾脏AQP-2的表达增加对水的重吸收,调节膀胱逼尿肌受体的表达维持膀胱正常收缩和舒张的功能,调节神经内分泌功能,三个方面进行全身的水液代谢调节的,佐证了“肾主水”的中医理论,并从水液代谢调节方面阐述了“肾主水”的作用机理。3益智仁盐炙后组成的缩泉丸不仅提高了君药益智仁入血成分生物利用度,同时还提高了配伍药物的生物利用度,益智仁盐炙缩尿作用增强可能与生物利用度增加有关,从药动学过程揭示了益智仁盐炙后组方的科学性。