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目的:利用噬菌体展示技术从噬菌体随机十二肽库中筛选出敏感的、可与华支睾吸虫病人血清IgG特异性结合的噬菌体克隆(即华支睾吸虫模拟抗原表位),分析其DNA序列、结构特点以及免疫活性,用混合噬菌体检测流行区采集的血清,为华支睾吸虫模拟抗原表位可否作为诊断抗原提供依据。
方法：
(1)用饱和硫酸铵沉淀法及离子层析法提取华支睾吸虫病人血清IgG。
(2)用紫外分光光度计测定纯化IgG的浓度并计算其蛋白含量,SDS-PAGE鉴定纯化IgG的纯度,斑点免疫金银染色(Dot-IGSS)检测纯化IgG的活性。
(3)用纯化IgG对噬菌体随机十二肽库进行3轮免疫亲和筛选。
(4)随机挑取30个噬菌体单克隆进行扩增,分析其DNA序列。
(5)Dot-IGSS和Western blot检测各阳性噬菌体单克隆的免疫反应性。
(6)选取不同的噬菌体克隆进行各种组合,用Dot-IGSS检测各组合的免疫反应性,并将免疫反应性最强的组合作为混合噬菌体。
(7)用混合噬菌体和华支睾吸虫成虫抗原(CsA),采用Dot-IGSS方法分别对流行区采集的血清进行检测。
结果：
(1)3.4ml华支睾吸虫病患者血清共收集到IgG3.5mg;SDS-PAGE电泳见两条目的条带,无杂带,达到电泳纯度;纯化IgG与华支睾吸虫成虫抗原斑点免疫金银染色反应结果为强阳性。
(2)3轮亲和筛选出的噬菌体回收率分别为4.83×10-6％、4.80×10-5％、6.04×10-4％,呈现出回收率逐轮上升的趋势,证明筛选出的噬菌体克隆有较高程度富集。
(3)30个噬菌体克隆的DNA中,有9个噬菌体单克隆有插入序列(P1～P9),其中有2个(P1和P2)的插入序列完全相同,其余克隆的插入序列均不相同。
(4)Dot-IGSS检测9个测出插入序列的克隆均可被华支睾吸虫病人血清识别。
(5)通过用Dot-IGSS检测病人血清,对筛选出来的阳性噬菌体克隆和CsA进行比较,显示这9个阳性噬菌体特异性及敏感性与CsA相比,差异无统计学意义。
(6)Western blot显示9个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫病人血清IgG反应,并且展示出线性表位。
(7)用混合噬菌体和CsA对流行区采集的血清以Dot-IGSS检测进行比较,混合噬菌体检测的阳性率和CsA检测的阳性率相似,差异无统计学意义,但混合噬菌体克隆检测的反应强度低于成虫抗原检测的反应强度,差异有统计学意义。
结论：
(1)利用噬菌体展示技术从噬菌体随机十二肽库中获得的阳性噬菌体克隆中含有表达华支睾吸虫抗原模拟表位的克隆。
(2)噬菌体随机肽库筛选的含有华支睾吸虫模拟抗原表位的克隆与CsA有相似的抗原性。
(3)筛选出的含有华支睾吸虫模拟抗原表位的混合噬菌体作为华支睾吸虫病的诊断抗原有可行性。