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胆汁淤积是以胆汁流动障碍为特点的一种临床综合征。胆汁酸在肝细胞内的滞留和超载是各种胆汁淤积的共同结果，其可引起肝细胞的凋亡或坏死，最终可导致肝硬化或其它终末期肝病。肝增大是胆汁酸超载时肝的一种保护性的适应性反应，但其发生的分子机制尚不清楚。类法尼醇X受体(farnesoidXreceptor，FXR)在肝细胞对胆汁酸超载的适应性反应中发挥着重要作用，FXR激动剂在胆汁淤积中的治疗作用是目前研究的热点。
本研究旨在探讨FXR在胆汁酸超载引起肝适应性增大中的作用，以为FXR激动剂用于胆汁淤积的治疗提供新的理论依据，并以期在此基础上找到新的治疗靶点。
第1章鹅去氧胆酸(claenodeoxycholicacid，CDCA)通过激活FXR引起C57BL/6小鼠肝肥大
目的:探讨胆汁酸CDCA引起的肝增大的组织学特点以及FXR在胆汁酸引起肝增大中的作用。
方法:
1.含1％CDCA的饲料和正常饲料(对照)分别喂养C57BL/6野生型小鼠和FXR基因敲除小鼠(FXRknock-out，FXR-KO)8周，应用HE染色和免疫组化方法观察CDCA处理后小鼠肝的组织学变化。
2.应用real-timePCR检测CDCA处理后野生型和FXR-KO小鼠肝内FXR的靶基因胆固醇7α羟化酶(cholesterol7α-hydroxylase，CYP7A1)mRNA表达的变化。
结果:
1.1％CDCA处理野生型小鼠8周后引起肝增大约50％(P<0.05)，HE染色结果显示肝细胞肥大的组织学特点。200倍视野下肝细胞计数显示，CDCA处理组野生型小鼠肝细胞数与对照组比较减少约20％(P<0.05)。然而，FXR-KO小鼠组织学检查显示自然发生的脂肪肝，CDCA处理后未引起肝细胞增大。针对细胞增殖标志物Ki67和cyclinD1的免疫组化显示，阳性细胞百分比在CDCA处理组和对照组没有显著性差异。针对5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine，BrdU)的免疫组化结果显示，在CDCA处理后肝细胞的阳性率也未见明显变化。
2.针对FXR靶基因CYP7A1的real-timePCR结果显示，CDCA处理野生型小鼠后显著抑制了肝内CYP7A1mRNA的表达(P<0.05)，而FXR-KO小鼠肝内CYP7A1脱阻抑。
结论:
1.胆汁酸CDCA引起C57BL/6野生型小鼠肝细胞肥大。
2.FXR介导CDCA引起的肝细胞肥大。
第2章FXR激活引起肝肥大的分子机制的探讨
目的:探讨FXR激活引起肝肥大的分子机制。
方法:
1.含1％CDCA的饲料和正常饲料分别喂养C57BL/6野生型小鼠和FXR-KO小鼠7天，观察CDCA处理后小鼠肝的组织学变化。
2.应用GeneChipRMouseGenome430A2.0Array基因芯片分析CDCA处理7天后野生型小鼠肝基因表达谱的变化，并从中挑选引起肝肥大的候选基因。
3.应用real-timePCR对候选基因进行确认，并应用westernblotting检测CDCA处理后HEX蛋白在野生型和FXR-KO小鼠肝内的表达变化。
结果:
1.CDCA处理7天后引起野生型小鼠肝增大约17％(P<0.05)，而未见FXR-KO小鼠肝重的明显变化。肝组织学检查确认了野生型小鼠的肝细胞肥大，但程度比CDCA处理8周后较轻。
2.基因芯片的结果显示，CDCA处理后野生型小鼠肝内分别约有200个基因上调或下调超过2倍，大部分基因与代谢、转录，信号转导和发育有关。FXR的靶基因CYP7A1和甾醇12α-羟化酶(sterol12α-hydroxylase，CYPSB1)的表达在CDCA处理组明显下调，证实了野生型小鼠肝内FXR的激活。我们从基因芯片数据中挑选出可能介导FXR激活引起肝肥大的4个候选基因，造血表达同源异形盒(hematopoieticallyexpressedhomeobox，HEX)，促甲状腺激素胚胎因子(thyrotrophicembryonicfactor，TEF)，REV-ERBβ和胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-likegrowthfactorbindingprotein1，IGFBP1)，其中HEX基因在肝的发育过程中引起细胞的形状和体积改变。
3.应用real-timePCR对这4个基因的检测确认了基因芯片的结果，其中CDCA对肝内HEX的表达调节表现为FXR依赖性，而其他候选基因表现为FXR非依赖性。应用westernblotting检测HEX蛋白在小鼠肝内的表达后发现，野生型小鼠肝内HEX蛋白水平在CDCA处理7天和8周后表达明显上调，而FXR-KO小鼠肝内HEX的表达未见明显变化。此外，realtimePCR结果显示，野生型小鼠肝内CYP7A1mRNA的表达在CDCA处理后明显下调，而FXR-KO小鼠肝CYP7A1脱阻抑，进一步证实了CDCA引起野生型小鼠肝内FXR的激活。
结论:
1.肝内HEX基因的表达上调依赖于FXR的激活。
2.HEX基因可能介导FXR激活引起的肝细胞肥大。
第3章FXR通过结合HEX基因的第1内含子上调该基因的表达
目的:探讨肝细胞内FXR对HEX基因的表达和转录调控。
方法:
1.从野生型和FXR-KO小鼠中分离肝原代细胞，应用100μMCDCA和/或1μM人工合成的FXR激动剂GW4064处理离体肝细胞3小时和24小时，并用real-timePCR检测HEXmRNA的表达变化。
2.应用real-timePCR和westernblotting检测HEX在人的肝癌细胞株HepG2和HuH7中的表达情况。递增浓度的CDCA处HepG2和HuH7细胞8小时后用real-timePCR检～UHEX和FXR的靶基因小异源二聚体配偶体(smallheterodimerpartner，SHP)mRNA的表达变化。
3.应用生物信息学软件TRANSFACRProfessional分析HEX基因内可能的FXR结合位点。应mHepG2细胞和小鼠肝原代细胞进行针对HEX基因的染色质免疫沉淀(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)，目的区域为HEX基因的远端(-1000/-500)和近端(-500/+1)启动子区，转录起始位点(+1/exon1)以及第1和第3内含子的保守区，100μMCDCA处理细胞24h后观察FXR对HEX基因结合的变化。应用EMSA和报道基因转染以进一步证实FXR通过结合HEX基因第1内含子增强子类似区内的IR-1类似元件以调控HEX基因。
结果:
1.Real-timePCR结果显示CDCA处理后野生型小鼠肝细胞内HEX和SHP的mRNA水平升高2～3倍(处理3小时差异有显著性，P<0.05)，然而FXR-KO小鼠肝细胞内这两个基因的mRNA水平未见明显变化。
2.FXR蛋白和mRNA在HepG2细胞中大量表达，但在HuH7细胞中表达缺失，而HEXmRNA在HepG2和HuH7细胞中都存在表达。CDCA处理HepG2和HuH7细胞8小时后，real－timePCR结果显示HepG2中HEXmRNA表达呈CDCA浓度依赖性的增加，其中100μMCDCA处理后上调HEXmRNA水平2.2±0.2倍(P<0.01)。同时，FXR的靶基因SHPmRNA的表达也呈CDCA浓度依赖性的升高。然而，HuH7细胞中HEX和SHP的mRNA水平在CDCA处理后未见明显变化。
3.我们应用生物信息学软件TRANSFACRProfessional在HEX基因的第1内含子保守区的增强子类似区鉴定出一个候选FXR结合位点(IR-1类似元件)。CDCA处理HepG2细胞后，抗乙酰组蛋白H3抗体引起了HEX基因中的远端(-1000/-500)启动子区，第1和第3内含子的保守区沉淀明显增加，而琼脂糖小球和对照抗体IgG作用后这些区域的沉淀未见明显变化。抗FXR抗体引起了人HEX基因的第1和第3内含子的保守区沉淀显著增加，而对照抗体IgG未引起这些区域沉淀的明显变化。CDCA处理离体小鼠肝细胞后，抗FXR抗体引起了野生型小鼠HEX基因的第1内含子的保守区沉淀显著增加，而FXR-KO小鼠离体肝细胞经CDCA处理后，FXR抗体未引起该区域沉淀的明显变化。
结论:
1.肝细胞内FXR的激活上调HEX基因的表达。
2.FXR通过与HEX基因的第1内含子内的增强子类似区结合调控该基因。