【摘 要】
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【目的】构建pPIC9k-SSA重组质粒,采用巴斯德毕赤酵母SMD1168表达系统表达SSA蛋白,对表达的蛋白产物进行纯化,并对SSA的抗原性质进行研究,建立相关的方法学检测。【方法】1.
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【目的】构建pPIC9k-SSA重组质粒,采用巴斯德毕赤酵母SMD1168表达系统表达SSA蛋白,对表达的蛋白产物进行纯化,并对SSA的抗原性质进行研究,建立相关的方法学检测。【方法】1.分离、培养人白血病淋巴细胞HL-60株,提取其RNA,以RNA为模板,通过反转录得到cDNA,再以cDNA为模板扩增出SSA基因。2.将SSA基因转入pPIC9k质粒构建pPIC9k-SSA重组质粒,并将重组质粒电转化导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统进行诱导表达,对产物进行初步纯化。3.将获得的SSA蛋白作为抗原,建立免疫斑点金渗虑法检测抗SSA抗体,以期为临床提供常规检测项目。4.对获得的SSA蛋白进行相关的抗原性研究。5.收集经ENA抗体谱检测抗SSA抗体阳性的SS病人血清作为阳性对照,收集经ENA抗体谱检测全阴性的健康体检者血清作为阴性对照,用于验证所建立的斑点免疫金渗虑法的敏感性、特异性及稳定性等。【结果】1.从人白血病cDNA文库中扩增出人SSA基因,成功构建pPIC9k-SSA重组质粒。2.将pPIC9k-SSA重组质粒导入毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中,获得稳定整合目的基因的菌株。3.重组菌株经诱导表达出产物相对分子量约为50 kDa的SSA蛋白,可与抗SSA抗体特异性结合。4.建立检测SSA抗体的斑点免疫金渗虑法方法。【结论】本实验室通过分子克隆技术,从毕赤酵母菌SMD1168真核表达系统中获得了人SSA抗原,应用初步纯化的真核表达产物(抗原)建立DIGFA法检测抗SSA抗体,敏感性和特异性与IB法相近,由于受到抗原纯化技术、样本数量、时间等的限制,本法的特异性、试剂的稳定性等有待进一步研究,但本法具有简便、快速和经济等优点,待进一步完善后值得在临床上的推广应用。
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