壳多糖耦联杆状病毒作为肝细胞靶向基因输送系统的研究

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壳多糖是天然存在的生物大分子,由单体N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成,带有很强的正电荷,能与带负电的质粒DNA依靠静电作用而形成相对稳定的复合体。壳多糖具有来源比较广泛、生物相容性好、可降解以及便于修饰等优点,在基因治疗中得到了很好的应用,是一种良好的基因载体,它另外一个突出的优点是对质粒DNA的大小没有特别的限制。 直接用壳多糖作为基因载体已经有了很深入的研究,但存在一个问题,大分子量的多糖分子一般比较难溶于水,壳多糖也不例外,根据文献的报道,为增加壳多糖的水溶性,可以在其上面修饰上利于水溶性的基团,从而增加其水溶性,便于在生理PH环境下的应用。本实验采用了另外一种途径,即将大分子量的壳多糖通过NaNO<,2>降解成低分子量的壳多糖,使其分子的极性相对增加,变得易溶于水,同时随着分子量的进一步降低,壳多糖对质粒DNA的运载能力又会下降。为了在壳多糖的水溶性与运载能力之间找到一个平衡,本实验对壳多糖的降解时间进行了控制,将高分子量的壳多糖分别降解1h、4h和10h,并通过凝胶层析过滤测得其分子量分别为80K、65K和35K,将三种不同分子量的降解后壳多糖经过透析纯化冻干及滤菌后,进行了细胞转染实验,结果证明了65K的壳多糖相对于其它两种壳多糖具有较好的基因转移效率,并测定了其氨基百分含量为55.5%。 壳多糖作为基因载体的另外一个缺点就使靶向性比较差,因此其应用范围就受到一定的限制,通常的方法可以在壳多糖上面接上具有生物靶向性的分子,如壳多糖上修饰上半乳糖基可以具有很好的肝脏靶向性。据报道,以昆虫为宿主的杆状病毒具有很好的生物安全性,更深入的研究发现虽然在人等哺乳动物体内不能复制,但具有很好的肝脏靶向性,很可能是通过受体介导的内吞作用进入,单独的杆状病毒就能使质粒的进入肝细胞的效率大大增加。本实验很好的重复了这个实验结果,证明了杆状病毒具有良好的肝脏靶向性和生物安全性,为了将壳多糖和杆状病毒的优点结合起来,我们采用了两种方法将病毒和壳多糖联用,一种是将杆状病毒粒子同壳多糖进行自组装混合,另一种是用EDC活化了壳多糖上面的游离氨基,将其同杆状病毒离子表面的羧基进行共价耦联,形成病毒-壳多糖复合物,利用β-gal和GFP两种报告基因的质粒进行转染肝实质细胞HepG2,实验结果证实了壳多糖显著提高了质粒的转染效率,而杆状病毒和壳多糖的自组装复合物则更增加基因转移的效率,共价耦联的病毒-壳多糖复合物则在此基础上又有了一定程度提高了转移效率,而在作为对照的Hela细胞中却没有观察到明显的提高。 通过实验证实了我们合成的这种崭新的载体具有很好的生物安全性,同时具有很好的靶向性和转移效率,通过不断的再深入研究,很有希望成为一种基因治疗的载体,为人类健康带来福音。
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