论文部分内容阅读
目的：建立一种新的采用酸化玻璃珠法分离纯化质粒DNA-蛋白复合物的方法，从pGL3-Control vector瞬时转染的293T细胞中分离SV40启动子的转录起始复合物，进而通过SDS-PAGE、考马斯亮蓝和快速银染色，初步分离纯化SV40启动子相关的转录因子，为进行肽质谱法分析鉴定转录因子奠定实验基础。
方法：⑴在宿主菌中转化和大量扩增pGL3-Control vector，制备足够的高纯度pGL3-Control vector。⑵以pGL3-Control vector瞬时转染293T细胞，优化质粒DNA转染后在细胞内高度表达的时间。⑶甲醛交联质粒DNA-结合蛋白复合体，以甘氨酸终止交联。⑷冻融法制备细胞裂解物，采用酸化玻璃珠法从细胞裂解物中分离纯化出质粒DNA-结合蛋白复合体。⑸质粒DNA-结合蛋白复合体解交联获得结合蛋白(即为SV40启动子的转录因子)。⑹丙酮沉淀蛋白，行蛋白SDS-PAGE，通过考马斯亮蓝染色和快速银染色观察结合蛋白在胶中的分离情况。⑺后期将会进行蛋白复合物的2-D PAGE及肽质谱法分析鉴定SV40启动子的转录因子种类。
结果：①pGL3-Control vector在293T细胞中可以高度表达荧光素酶蛋白，在质粒转染后不同时间点上检测各组细胞的荧光素酶蛋白表达量，确定了质粒转染后高度表达的时间优化结果为40h左右。②通过反复冻融法可以获得大量的细胞裂解物，并采用酚氯仿法从细胞裂解物中成功地抽提到pGL3-Control vector，质粒PCR扩增后鉴定效果好。③通过甲醛交联pGL3-Control vector DNA-结合蛋白复合体和酸化玻璃珠缠绕法成功地从细胞裂解物中分离纯化出质粒DNA-结合蛋白复合体。④pGL3-Control vector DNA-结合蛋白复合体经解交联和丙酮沉淀后，行蛋白复合物SDS-PAGE，可以明显看到不同分子水平的蛋白条带，且大分子条带居多。⑤收集6平皿(100mm直径的细胞培养皿)细胞，反复冻融法裂解后通过以上方法获得蛋白复合物，经过蛋白浓度测定了解了该一系列方法所提取的蛋白复合物的浓度大小。
结论：甲醛交联质粒DNA-蛋白复合体、反复冻融法裂解细胞、酸化玻璃珠法分离纯化质粒DNA-蛋白复合体等实验方法可行、有效，其分离鉴定转录因子的完整方案还有待进一步的实验验证。