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第一部分ROCK抑制剂在角膜保存中的作用研究目的通过在角膜中期保存液中添加ROCK抑制剂Y-27632,观察其对保存角膜上皮细胞活性率、角膜缘干细胞增殖能力、角膜内皮细胞活性的影响。方法新鲜兔角膜15只,4℃保存在含10μM Y-27632的角膜中期保存液中,保存时间为0、1、4、7、14天,未添加Y-27632的角膜中期保存液作为对照组。通过检测角膜缘上皮细胞的活性率、干细胞克隆形成能力,分析Y-27632对保存的角膜材料中角膜缘干细胞的影响；同时,使用台盘蓝一茜素红染色观察中央角膜内皮细胞形态的变化并计数内皮细胞活性数,初步评估Y-27632对角膜内皮细胞保存的影响。结果新鲜角膜材料在添加Y-27632的角膜保存液中保存7-14天,分离的角膜缘上皮细胞仍具有较强的细胞活性率及克隆形成能力。对角膜内皮行台盘蓝一茜素红染色显示,在添加Y-27632的角膜中期保存液保存14天后,角膜内皮细胞仍能维持其正常形态,活性无明显变化。结论初步试验结果显示,Y-27632可作为角膜中期保存液的添加物,能够有效延长角膜上皮和角膜内皮细胞在体外的保存时间。第二部分ROCK抑制剂在角膜缘干细胞冻存中的作用研究目的通过在角膜缘上皮细胞的体外扩增、冻存复苏过程中添加ROCK抑制剂Y-27632,观察其对角膜缘上皮细胞活性和干细胞克隆形成能力的影响。方法将新鲜分离的上皮细胞或经过扩增的兔角膜缘上皮细胞冻存,根据冻存液及培养过程中是否添加Y-27632将细胞进行不同的分组,Y-27632的添加浓度为10μM。观察各组细胞冻存、复苏后细胞活性、克隆形成能力等情况,评价Y-27632在角膜缘干细胞低温冻存、培养中的作用。结果在角膜缘上皮细胞培养过程中添加Y-27632,可显著促进细胞增殖,提高角膜缘上皮细胞的克隆形成能力。将体外扩增后的角膜缘上皮细胞进行冻存复苏后发现,只在冻存液中添加Y-27632的细胞,短期冻存复苏后的细胞,在细胞活性和克隆形成能力未见显著改变,但中长期冻存(>14天)复苏后的角膜缘上皮细胞,在细胞活性、增殖和克隆形成能力有明显提高；在体外扩增和冻存复苏全程中添加Y-27632时,角膜缘上皮细胞经过冻存、复苏后其活性、增殖能力和克隆形成能力与其它组相比均有显著提高,且其活性和功能与冻存前的水平相当。结论Y-27632在低温冻存、复苏培养过程中对角膜缘干细胞具有明显的保护作用,能够保持角膜缘干细胞活性,提高干细胞增殖和克隆形成能力。