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本论文根据发酵过程优化与放大技术的需要,结合国内外相关的发酵过程在线检测和控制装置技术的最新进展,进行了可控pH摇床、原位细胞显微观察仪、智能精确补料系统等新型装置的研制与发酵过程应用,同时对原位细胞浓度检测传感器在酵母细胞和动物细胞高密度培养应用也进行了研究,具体结果如下。
1.6-通道pH检测、控制与补料摇床的研制与发酵研究应用
在发酵过程中,pH是反映菌体生理代谢的环境参数,其变化与细胞生理代谢有紧密的相关性,过程的pH变化是发酵优化的有效参数之一。因此,6-通道pH检测、控制与补料摇床基于上述原理而设计和研制,包括专用摇瓶、pH精确测量系统和精细补料系统等。然后,以梅岭霉素、红霉素和乳酸发酵为研究对象,探索了不同发酵过程种子培养和发酵过程特性、培养基优化、改变培养条件(如调节pH、补料等)对发酵过程的影响等。实验结果表明,利用pH摇床研究获得的数据可靠、操作简便、实验高效。
2.原位细胞显微观察仪的设计及其在酵母和动物细胞培养中的应用研究
在微生物(细胞)培养过程中,细胞形态是细胞基因型与环境共同作用的结果。通常细胞形态是通过取样、离线显微镜观察获得的,缺乏在线动态观察,为此,本论文提出了研制新型在位显微图像处理装置的设想,并首先提出了基于暗视野可更换光源的原位细胞显微观察原理,研制出原位显微观察仪样机,将其应用于酿酒酵母细胞、重组动物细胞(HEK293)培养研究,对在位实时观察细胞形态的新型显微观察仪的研制原理可行性和使用效果进行验证。结果表明：基于暗视场可更换光源的原位细胞显微观察原理有明显优点,原位细胞显微观察时采样系统独特,应用于酵母细胞和动物细胞培养在线原位细胞显微观察可靠性高。自行研制的高分辨率原位在线细胞显微观察仪定型为ZYLH-1000,达到如下综合技术指标：①可在线高温高压消毒(120℃～131℃蒸汽,<2.5个标准大气压,30min);②目视放大倍数：600X;③17"显示器实际放大倍数：>2000X;④测量范围：0.5～50μm;⑤分辨率：0.5μm;⑥调焦范围：±4μm;⑦标配130万像素CCD;⑧在线自动取样装置；⑨可调光强照明系统。因此,研制的装置完全满足了酵母细胞和动物细胞培养在线原位细胞的显微观察,为实现培养过程的优化提供了可靠的数据信息。
3.新型智能称量式补料装置的设计及其在重组毕赤酵母高密度发酵中的应用研究
发酵过程中基质的物料流调控往往是过程优化的关键,因此准确计量、实施营养物质的流加是实时代谢流优化的关键。本论文正是基于上述要求设计研制了一种智能称量式补料装置,该装置可实现补料控制精确度高、重复性好和抗干扰能力强、补料精度有自校正精度计算和具有智能报警等多种功能,完全满足工业发酵的中试和大规模生产过程中补料的要求。同时,将此补料系统运用于实际的25m3重组毕赤酵母发酵生产植酸酶过程中,实现了过程中的精确补料控制和甲醇基质底物的浓度,211h植酸酶表达量达到23,077U/mL,表达量超过了现有文献报道水平。此智能称量式系列补料装置可应用于中试研究和实际生产中。
4.新型在线活细胞浓度检测仪在酵母细胞高密度发酵中的应用研究
在发酵过程研究中,大量代谢“活”细胞的存在是生物过程得以持续进行的前提条件,活细胞真实浓度是发酵过程中的重要重参数之一,所以发酵过程中实现活细胞浓度的在线检测是研究人员长期渴望解决的技术。本论文在国内率先引进在线活细胞浓度检测仪(ABER 210)传感器装置,并对其开展了应用研究,对在线检测的原理进行了验证,同时对实际使用方法也进行了探索。通过对重组毕赤酵母菌种(YP-99)培养的在线活细胞浓度检测,发现在采用复合培养基高密度培养重组酿酒酵母生产谷胱甘肽过程中,与传统的活细胞浓度测定方法(PMV、OD600、CFU和干重法等)相比,活细胞传感仪所获得的数据均具有很好的线性相关性,相关系数达0.98以上,说明该活细胞浓度传感器有较好的灵敏度、精确度和可靠性。通过活细胞浓度的检测,定量得到了比生长速率、产物比形成速率、底物比消耗速率等较原来OUR、CER等间接生理参数更为重要的生理代谢特征参数,为发酵过程的优化研究提供了一个全新的研究视角。
综上所述,本论文根据发酵过程优化与放大实时细胞代谢参数检测的需要,研究了发酵过程三种新型装置技术,并与合作者研制出了符合发酵过程研究所需的装置,为发酵过程与细胞代谢相关参数的实时在线检测奠定了基础。与此同时,又将三种研制的装置和一种新型细胞在线传感器成功应用于不同的发酵过程中,并探索了使用方法,所取得的发酵过程数据完善了原有发酵过程优化研究的参数和方法,为发酵过程优化理论提供了新的技术参数和手段。