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研究背景急性睡眠剥夺（Acute sleep deprivation,ASD）于人群中的发生率越来越高,其对大脑最重要的影响是损害日间功能和学习记忆过程,但目前能够改善学习记忆的治疗方法和措施却极为有限,其根本原因在于睡眠剥夺损害学习记忆的机制及干预靶点不明确。近年来,越来越多的研究显示Orexin及其受体不仅是睡眠-觉醒周期的关键调节因子,也参与海马相关的学习记忆。海马区对睡眠剥夺非常敏感,且富含Orexin受体,睡眠剥夺可激活Orexin神经元,进一步影响Orexin系统功能,细胞内信号通路中研究显示Orexin-A与其受体结合后主要通过Gq/PLC/PKC通路激活ERK1/2,ERK1/2信号途径又在海马神经发生中发挥重要作用,而海马神经发生又与学习记忆密切相关。基于此,能否通过干预Orexin信号通路减轻ASD相关学习记忆损害是本研究的出发点。研究目的建立急性睡眠剥夺（ASD）大鼠模型,观察睡眠剥夺后大鼠下丘脑Orexin-A的表达。利用腺相关病毒（AAV）下调大鼠海马Orexin受体,分别观察ASD对ASD后、睡眠恢复14天及28天后的学习记忆及神经发生的影响和改变,观察下调海马Orexin受体表达是否改善ASD相关学习记忆损害和神经发生损害,并观察海马PLCβ1和磷酸化ERK1/2蛋白的表达,进一步探讨其可能的通路机制。研究方法1.建立急性睡眠剥夺大鼠模型并观察下丘脑Orexin-A的表达对8-10周龄健康雄性wistar大鼠行Y迷宫强迫交替实验筛选后随机入组,在正式睡眠剥夺前,大鼠需放入睡眠剥夺箱中适应环境3天。睡眠剥夺时,每个剥夺箱中放入2只大鼠,同时减少外部实验环境的干扰。设置金属杆的移动周期为:10 s（运行）/110 s（停止）。通过模拟人工轻抚方式对大鼠进行触觉刺激,建立持续72h的急性睡眠剥夺模型。免疫组化方法观察72 h急性睡眠剥夺后大鼠下丘脑外侧区Orexin-A的表达。2.建立腺相关病毒干预模型利用携带目的基因的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）干扰海马CA1区Orexin双受体（OXR）基因表达,建立海马CA1区OXR低表达大鼠模型。根据受体基因序列,首先进行病毒siRNA基因载体设计,并通过PCR和Western blotting技术于海马原代细胞进行转染、筛选和验证,最终选择稳定的蛋白和基因低表达的序列进行大鼠海马CA1区立体定位注射。术后大鼠恢复2周,进入后续实验。3.标记新生神经细胞5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）可以代替胸腺嘧啶核苷进入到细胞增殖过程以标记海马区新生神经细胞。为了观察ASD期间神经细胞的增殖情况,在ASD造模期间每天固定时间点腹腔注射BrdU,并通过免疫荧光观察标记的BrdU神经细胞。4.评价学习记忆能力利用Morris水迷宫和Y迷宫评估各组大鼠的空间学习记忆能力,评估的内容主要包括:自发交替次数、逃避潜伏期、平台穿越次数,游泳和运动速度等。评估时间为ASD后（0时间点）、睡眠恢复14天（14天时间点）和28天（28天时间点）后。5.免疫荧光染色及分子生物学指标检测应用免疫荧光共标观察干预后各组大鼠的海马区的BrdU表达（0时间点）、BrdU和DCX共标表达（14天时间点）以及BrdU和NeuN共标表达（28天时间点）,使用共聚焦显微镜观察和半定量统计学分析。应用Western blotting、rt-PCR方法对ASD后（0时间点）大鼠海马磷酸化ERK1/2和PLCβ1的表达进行测定。研究结果1.通过触觉刺激模拟人工轻抚法采用睡眠剥夺箱对大鼠进行连续72 h急性睡眠剥夺的过程稳定,未观察到明显的打架等激惹事件。ASD后大鼠“报复性”睡眠增多,表明实验ASD模型成功构建。此外,我们观察到ASD后下丘脑外侧区Orexin-A阳性表达明显增多。2.ASD干预后各组大鼠行为学实验显示,ASD后大鼠自发交替次数减少,逃避潜伏期时长延长,空间探索任务中的穿越平台次数减少。而与ASD组大鼠相比,海马OXR下调干预组大鼠的自发交替能力稍强,逃避潜伏期时长缩短,平台穿越次数增加,差异有统计学意义。睡眠恢复14天后ASD大鼠的逃避潜伏期依旧延长,但自发交替能力及空间探索能力与对照组相比无明显差异。睡眠恢复28天后各组大鼠行为学实验无明显差异。这表明ASD损害了大鼠的短期工作记忆和空间学习记忆能力,但这种学习记忆的损害可随睡眠恢复后而减轻和恢复,下调海马OXR可以减轻该损害的发生。3.ASD干预后各组大鼠免疫荧光显示,ASD后大鼠BrdU阳性神经细胞减少,睡眠恢复14天后,BrdU和DCX共标显示的ASD期间产生的神经细胞迁移分化个数减少,睡眠恢复28天后BrdU和NeuN共标显示的ASD期间新生的神经细胞走向成熟的神经元个数减少。而下调海马OXR组大鼠上述3个时间点观察到的神经细胞较ASD组增多。这表明ASD损害了大鼠的神经发生过程,下调海马OXR可以减轻该损害的发生。4.对ASD干预后（0时间点）各组大鼠海马区磷酸化ERK1/2和PLCβ1蛋白进行免蛋白免疫印迹法检测,观察到ASD后上述蛋白表达增加,下调海马OXR组大鼠表达趋势则与对照组一致。表明72hASD可以引起上述蛋白的激活,而下调海马OXR后可以减轻这种过度激活。研究结论本研究成功建立了 ASD大鼠模型,ASD后下丘脑外侧区Orexin-A表达增多。72 hASD可损害wistar大鼠的短期和长期空间学习记忆,但该损害过程可在睡眠恢复14天后改善。72 hASD可抑制海马新生神经元的生成、迁移分化和成熟过程,下调海马Orexin受体可减轻ASD造成的认知功能损害,并保护海马区神经发生过程。这一过程可能与Orexin-A-PLCβ1-pERK1/2通路相关。