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布鲁氏菌病（Brucellaabortus）是革兰氏阴性菌，专性细胞内寄生，可感染人类及多种动物引起发热、流产、不育、慢性关节炎及神经损伤等，导致世界范围严重的经济损失和公共卫生问题。目前尚没有有效的防治手段，疫苗接种是预防该病的主要手段。藓醇激酶（ery）是流产布鲁氏菌的毒力基因，本研究通过对牛种布鲁氏菌S2308株ery启动子基因敲除构建ery启动子基因缺失株，观察是否可降低毒力；评价该缺失株作为疫苗候选株的价值；同时表达了eryA蛋白，为区别布鲁氏菌自然感染与疫苗免疫提供包被抗原；另外，S19疫苗株在防治牛布病方面取得明显的效果，但是牛种布鲁氏菌疫苗S19免疫怀孕的动物可能导致其流产，且常规的血清学检测与诊断方法不能将其与自然感染相区分，这对我国布病的防治与净化是不利的。前期研究表明布鲁氏菌WboA基因编码糖基转移酶，是合成LPSO-侧链多糖的必需基因之一，M5-90wboA敲除株可以区别自然感染和疫苗感染。但M5-90敲除WboA株保护率比亲本株降低10％本研究拟对S19wboA基因的抗原表位分析并构建自杀载体为S19疫苗株的进一步改造提供科学依据。 本研究以灭活的流产布鲁氏菌S2308株为模板，扩增赤藓醇激酶（ery）启动子基因的上下游同源臂序列；以枯草芽孢杆菌为模板，扩增SacB基因序列。将扩增好的序列分别连接到自杀载体pGEM-7Zf+上，成功构建了pGEM-7Zf-ery-sacB自杀载体，将构建好的载体命名为：pes，然后将pes电转至流产布鲁氏菌S2308株感受态细胞，通过同源重组的方法成功构建S2308ery启动子基因缺失株，命名为：S2308Δery，对S2308Δery株进行了遗传稳定性检测，传至15代遗传稳定。用S2308Δery株侵染胚胎滋养层细胞，细胞脱落结果显示：S2308Δery株的毒力较亲本S2308株明显下降，其毒力与S19株相当。该缺失株通过缺失S2308ery启动子基因，将ery整个开放阅读框失活，为S2308株向疫苗株的改造奠定基础。 用DNAman和GENGrunner对wboA基因进行了抗原表位分析，选取抗原表位1（w-1）、抗原表位2(w-2)、抗原表位1和2（w-1-2）及wboA作为本试验的研究对象。以灭活的S19为模板，成功扩增了wboA基因及其3个抗原表位基因；以灭活的流产布鲁氏菌S2308株为模板，成功扩增了eryA基因。本试验成功构建了wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因的原核表达载体，IPTG诱导表达，SDS-PAGE凝胶电泳显示：wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因蛋白在原核表达载体中成功表达；westernblot分析结果显示：wboA基因及其抗原表位基因和eryA基因具有良好的免疫反应性。对wboA及其抗原表位蛋白和S2308株eryA蛋白进行了纯化。wboA及其抗原表位蛋白为后续的S19疫苗改造以及相应相应缺失株的血清学的鉴别诊断奠定了基础。eryA蛋白为S2308Δery株的血清学鉴别诊断奠定了基础。 对wboA及其抗原表位基因的上下游同源臂基因进行了扩增，扩增了负筛选标记SacB基因。分别将wboA基因及其抗原表位基因的上下游同源臂连接到自杀载体pGEM-7Zf(+)上，再将SacB基因连接到带有上下游同源臂的自杀载体上，成功构建了wboA及其3个抗原表位同源重组自杀载体，将构建好的自杀载体命名为：pws、pw-1-s、pw-2-s、pw-1-2-s。通过构建的同源重组质粒，然后敲除相应的基因，为建立相应的能有效区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌S19弱毒基因缺失疫苗奠定基础。