蛋白质高灵敏检测分子荧光探针研究

来源 :同济大学理学院 同济大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:dancy_y
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蛋白质是生命内最重要的生物大分子,是生命活动的物质基础,是生物体内一切组织的基础物质,并在生命现象和生命过程中起着决定性的作用,它与营养、酶、病毒、免疫、物质运输、遗传、生命等都有密切关系。对蛋白质进行定量分析和特异识别探讨生命机理是十分重要的,其浓度和结构的研究在医学及免疫等方面有着极其重要的意义,对生命奥秘的揭示、临床诊断以及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。在众多的痕量蛋白的检测方法中,荧光分析法因其具有灵敏度高、选择性好、动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环境的优点而在蛋白质分析中应用广泛。荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究溶液中蛋白质高灵敏度的分析方法,因而近年来,随着技术的不断进步,荧光探针法作为一种检测新型的蛋白定量检测方法。以其干扰少、快速、灵敏度高、准确、实用性而备受关注。本文尝试用荧光染料试剂灿烂甲酚蓝(Brilliant Bresol Blue,BCB)和吖啶橙(Aeridine Orange,AO)作为荧光探针,通过荧光探针法对Tau蛋白的定量检测进行了一系列的探索,通过系统研究两种检测体系的反应条件,获得确定的研究成果,主要内容如下:1、分别以灿烂甲酚蓝(brilliant cresol blue,BCB)和吖啶橙(Acridine Orange,AO)做为荧光探针,以人血清蛋白(HSA)作为蛋白质模型分子,以Tris-HCl作为缓冲溶液作为介质,讨论了不同实验条件,如溶液PH值,染料试剂的用量,试剂加入顺序,反应时间,反应温度,溶液离子强度对荧光强度的影响,以此优化了实验条件。2、通过实验发现,在近似中性的范围内,灿烂甲酚蓝(BCB)和人血清蛋白(HSA)结合,可使BCB溶液的荧光强度加强,且荧光强度的加强程度与蛋白质的浓度具有较好的线性关系。其线性范围为1×10-5mg/ml-2×10-2mg/ml,相关系数为0.9932,检测限为9.93ng/ml,相对标准偏差(n=6)为3.09%,实验表明该方法使用简单方便,具有较高的灵敏度。3、通过实验对AO-SDS-HSA三元荧光体系的研究发现,在一定的条件下,蛋白质的加入可使AO-SDS形成的聚合体解散,从而使体系的荧光强度加强,且荧光强度的加强程度与蛋白质的加入量成正比。其线性范围为2×10-6mg/ml-2×10-2mg/ml,相关系数为0.9984,检测限为1.82ng/ml,相对标准偏差为1.61%,该方法相比于前一种方法具有更高的灵敏度且具有较强的抗干扰能力。4、论文还使用了上边两种探针对Tau蛋白R3多肽片段进行了检测实验,通过实验发现应用灿烂甲酚蓝荧光探针法可检测到Tau蛋白R3多肽片段的效果不是很理想;而应用吖啶橙荧光探针法对Tau蛋白R3多肽片段的线性相关系数R2=0.9951,检出限(n=6)可达到1.33ng/ml。具有检测下限低,检测灵敏度较高的优点。
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