论文部分内容阅读
蝙蝠属于翼手目(Chiroptera),是唯一真正具有飞翔能力的同时也是自然界种类第二多的哺乳动物。蝙蝠被认为是许多重要人兽共患病毒的自然宿主,例如SARS-冠状病毒、丝状病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、肝炎病毒等。本课题组前期通过病毒宏基因组学技术对中国各地蝙蝠携带病毒进行病原生态研究,发现了多种细小病毒和圆环病毒,在种类和数量上体现了丰富的多样性。因此,本课题对我国广西、广东、云南三个省份蝙蝠携带的细小病毒遗传多样性进行研究,同时首次构建了蝙蝠圆环病毒的感染性克隆研究其基因组中特殊结构的功能。细小病毒(Parvoviridae)种类众多,目前有13属60种,其宿主范围广泛,包括多种昆虫和哺乳动物。研究人员曾在蝙蝠体内发现了多株博卡病毒和腺相关病毒,但从未系统研究过。本研究在中国广西、广东、云南三个省份共采集了1311份蝙蝠样品,分别属于狐蝠科、蹄蝠科、蝙蝠科和菊头蝠科。应用高通量测序对其中所携带的病毒进行研究,共注释到病毒序列285788条,其中脊椎动物病毒32272条,植物病毒2049条,噬菌体237912条,昆虫病毒13555条。在脊椎动物病毒序列中,数量最大的是细小病毒,注释到了21809条,遍及细小病毒亚科的8个属。序列分析组装后进行验证,共发现18种不同的细小病毒,PCR检测发现在蝙蝠群体中的阳性率为2.8%-100%。同源性分析显示,该18种蝙蝠细小病毒与ICTV参考毒株氨基酸同源性皆低于85%,全部为细小病毒科新种。对其中的10种细小病毒进行基因组扩增,利用普通PCR和染色体步移(genomewalking)等技术获得了其全部或部分编码区。遗传演化分析显示,该十种新型细小病毒有4种属于Dependoparvovirus属,2种属于Bocaparvovirus属,一种属于Amdoparvovirus属,一种属于Tetraparvovirus属,一种属于Protoparvovirus属,还有一种可能与另一蝙蝠细小病毒构成一个新的属。圆环病毒(Circoviridae)是世界上最小的DNA病毒之一,基因组只有1.7-2.2kb,含有两个主要的开放阅读框。圆环病毒宿主广泛,可以感染哺乳动物、鸟类、鱼、昆虫等,同时一些圆环病毒感染也与人的疾病有关。由于缺少合适的细胞系,圆环病毒很难在体外进行分离培养,无法深入的研究其生活特性和致病性。因此本研究首次构建了蝙蝠圆环病毒感染性克隆,研究其基因组中一段特殊的多聚嘧啶结构(poly-T)的功能。该poly-T由25-29个连续的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸组成,位于基因组两个开放阅读框3’基因间隔区。我们构建了两个串连双拷贝的蝙蝠圆环病毒感染性克隆——野生型(wtBatACV)和poly-T缺失型(ΔTBatACV),通过电镜观察和圆环病毒核酸检测证明两株蝙蝠圆环病毒被成功拯救。通过体外转染和间接免疫荧光实验观察,显示两种感染性克隆包装病毒粒的速度、能力没有明显差别,推测该poly-T结构对圆环病毒“生命周期”没有影响。细小病毒和圆环病毒作为两大类小型DNA病毒在自然界中具有非常广泛的分布和多样性。本研究系统调查了我国蝙蝠细小病毒的遗传多样性,在中国南部沿海三个省份不同地区的4个科5个属共17种蝙蝠中,详细调查了细小病毒亚科8个属的细小病毒在蝙蝠中的存在情况,并发现了18种新型细小病毒,为中国细小病毒种类和分布提供了重要的基本数据。同时本研究首次构建了蝙蝠圆环病毒感染性克隆,成功拯救出蝙蝠圆环病毒粒子,从功能上鉴定了其基因组中的poly-T结构,增加了我们对圆环病毒基因组的认识。