论文部分内容阅读
本试验主要研究己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)染毒雄性成年仓鼠对其睾丸和附睾生精细胞凋亡及其后代生精细胞凋亡的影响及枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)的缓解作用。将90只成年雄性仓鼠正常饲养7 d后,随机分为6组(n=15)。于末次给药24 h后,每组均随机选取5只仓鼠,乙醚麻醉致死,取出睾丸快速分离睾丸周围的脂肪,放入波恩氏液中固定,制作石蜡切片,应用免疫组化方法测定Caspase-8、Caspase-9、P53、ER及AR的表达与定位;另外摘取两侧附睾,左侧附睾尾放于波恩氏液中固定,制做石蜡切片,HE染色观察其组织学变化,免疫组织化学法检测凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9、P53的表达与定位;右侧附睾尾于37℃生理盐水中剪碎,取精子悬液观察精子形态,计算精子密度和畸形率。末次给药24 h后,各试验组均随机选取5只雄性仓鼠,与发情母鼠按1:2比例合笼,连续2个发情周期(9 d),每天早晨,对雌鼠进行阴道涂片,镜检发现精子者视为合笼成功,记为孕1 d。将怀孕母鼠单独饲养,期间喂给正常的饲料和水,待其分娩。分别记录每只母鼠妊娠率、妊娠日期、产仔数、雌雄比例、仔鼠PND 0 d、7 d、14 d、21d、28 d和56 d体重。饲养雄性仔鼠至性成熟,乙醚麻醉致死仓鼠,取睾丸组织,称量并计算器官指数,将睾丸固定在波恩氏液中,制作石蜡切片,观察组织学变化,并检测睾丸中Fas、Fas L及Caspase-3的表达与定位;分别摘取两侧附睾,称重并计算器官指数,左侧附睾尾放于波恩氏液中固定,制做石蜡切片,HE染色观察其组织学变化;右侧附睾尾于37℃生理盐水中剪碎,取精子悬液观察精子形态,计算精子密度和畸形率。6个试验组中剩余的30只雄性仓鼠,继续饲喂3个月,观察3个月后仓鼠睾丸的组织学变化;取附睾,计算精子密度和畸形率。结果显示:(1)F0代成年雄性仓鼠用DES处理后,附睾组织形态发生明显变化;补充LBP后,附睾管上皮细胞排列整齐,结构完整,损伤明显减少,尤其是在LBP高剂量组(50 mg/kg)是最明显的,维生素组附睾组织形态也得到很好的恢复,且LBP高剂量组与维生素组无显著差异。DES显著降低F0代仓鼠精子数量,提高精子畸形率(P<0.01),而LBP可以提高F0代雄鼠精子数量,降低畸形率,维生素对精子数量和畸形率也有显著作用。通过免疫组化法检测证实,DES引起F0代成年仓鼠睾丸内生精细胞大量凋亡,显著提高Caspase-9的表达(P<0.01);给予不同剂量的LBP后,Caspase-9及P53的达呈剂量依赖性降低,以LBP高剂量组表达最低(P<0.01),同时LBP高剂量组的Caspase-8阳性表达与对照组相比差异不显著。DES显著降低AR基因的表达(P<0.01),添加LBP后,各治疗组AR的表达量随LBP剂量升高而增加。DES能够使ER基因表达显著升高,LBP应用后ER表达量均减少。DES可显著增加F0代仓鼠附睾组织中Caspase-8、Caspase-9及P53的表达(P<0.01),添加LBP后,1/10/50 mg/kg LBP组凋亡蛋白Caspase-8的表达较DES降低(P<0.01),10/50 mg/kg LBP组Caspase-9的阳性表达较DES降低(P<0.01),50 mg/kg LBP组凋亡蛋白P53的表达较DES降低(P<0.01)。(2)与DES组雄鼠交配的10只雌鼠中,仅有4只怀孕,1 mg/kg LBP组和10 mg/kg LBP组雌鼠的妊娠率分别为60%和70%,对照组、50 mg/kg LBP组和维生素组雄性仓鼠与发情雌鼠合笼,3个组中雌鼠全部怀孕。各组间雌鼠妊娠日龄、产仔数、出生重及仔鼠雌雄比例比较,均差异不显著。F1代仔鼠PND 7 d体重,各组间比较均没有显著差异。DES组和维生素组仔鼠PND 14 d和PND 21 d体重显著低于对照组和LBP各剂量组(P<0.05),LBP各剂量组仔鼠PND 14 d和PND 21 d体重与对照组没有显著差异。DES组仔鼠PND 28 d体重与对照组相比差异显著(P<0.05),LBP各剂量组仔鼠PND 28 d体重与对照组相比没有显著差异,与对照组相比,维生素组仔鼠PND 28 d体重差异明显(P<0.05)。仔鼠成年后(PND 56d)体重各组之间比较,维生素组为110.77 g,显著低于对照组的135.80 g(P<0.05),DES组和LBP各剂量组与对照组相比没有明显差异。F1代仓鼠睾丸重量及其器官指数各组之间比较,没有差异。DES组、1/10 mg/kg LBP组和VC+VE组F1代附睾重量及附睾器官指数和精子数量低于对照组,而50 mg/kg LBP组与对照组相比差异不显著。DES组、1 mg/kg LBP组F1代仓鼠睾丸组织结构有轻微损伤,10/50 mg/kg LBP组睾丸组织接近正常;各组间F1代附睾组织形态正常。各组间F1代仓鼠精子畸形率比较无显著性差异。DES组、1 mg/kg LBP组F1代睾丸中Fas的表达较对照组显著增高(P<0.01),10/50 mg/kg LBP组和维生素组无显著变化。DES组、1/10mg/kg LBP组F1代睾丸中Fas L的阳性表达较对照组显著增高(P<0.01),50 mg/kg LBP组和VC+VE组相比差异不显著。F1代睾丸组织中Caspase-3的阳性表达,除DES组显著高于对照组外其他各组与对照组相比没有差异。(3)经过3个月的恢复后,各组的睾丸和附睾重量及睾丸组织形态皆恢复到正常水平,精子畸形率也降低到正常水平,DES组、1/10 mg/kg LBP组和VC+VE组精子数量显著低于对照组,50 mg/kg LBP组恢复到对照组水平。各组仓鼠恢复3个月后,其体重均较用药结束时有显著增加(P<0.01);睾丸重量较用药结束时均有增加,但没有显著差异;1 mg/kg DES组和维生素组附睾重量分别增加81.25%和55.81%,但差异不显著;1 mg/kg LBP组和10 mg/kg LBP组附睾重量恢复前后比较,差异显著(P<0.05);而50 mg/kg LBP组附睾重量由0.46 g增加到0.73 g,差异极显著(P<0.01)。经过3个月恢复后,DES组、1/10 mg/kg LBP组和维生素组精子数量与结束用药时相比,精子数量均显著增加(P<0.01);50 mg/kg LBP组精子数量恢复前后变化不明显。精子畸形率恢复前后的比较结果显示,各组仓鼠恢复3个月后,精子畸形率均较结束用药时显著降低(P<0.01)。结论:(1)DES造成睾丸生精细胞大量凋亡,改变附睾结构,增加附睾凋亡蛋白Caspase-8、Caspase-9和P53表达,扰乱AR和ER正常功能,降低精子数量,增加精子畸形率,导致成年雄性仓鼠生殖损伤,生育能力降低。补充不同剂量的LBP后,LBP减少睾丸生精细胞和附睾上皮细胞凋亡,使附睾损伤程度减轻,纠正AR和ER功能,增加精子数量,减少精子畸形率,缓解DES对F0代雄性仓鼠造成的生殖损伤。(2)DES对F1代仓鼠生殖能力造成不良影响,包括降低仔鼠PND14 d、21 d、28 d和56 d体重,降低F1代附睾重量及其器官指数,减少精子数量,增加睾丸生精细胞Fas/Fas L及Caspase-3蛋白的凋亡。应用LBP后,可以缓解DES对F1代造成的生殖损伤,其中以LBP高剂量组的作用最明显。(3)成年雄性仓鼠用DES处理后,经过3个月正常饲喂,各项生殖指标均有不同程度好转,但精子数量仍低于对照组;而用LBP处理的仓鼠各项指标恢复良好,且50 mg/kg LBP组精子数量恢复到正常水平,说明LBP有助于DES引起的生殖损伤恢复。