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随着人们逐渐对口腔健康的关注,口腔疾病的防治成为近些年的研究热点。在牙周炎的病程中,由炎症引起的牙槽骨改建障碍会引起牙槽骨丧失甚至牙齿脱落,是成年人失牙的最主要原因之一。脂多糖(Lipopolysaccharide LPS)作为其最重要的致病因子,在牙周炎引起的骨吸收上也起着重要作用。如何控制牙周病的进程,减少骨质破坏,促进牙周组织修复再生,恢复正常的生物学宽度,一直是牙周病防治的研究重点。人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblast HPDLFs)是牙周膜组织的主要组成部分,在牙周组织改建中发挥重要作用。早期研究表明,骨稳态的维持依赖于细胞间直接作用和细胞间物质分泌。有研究表明,HPDLFs可表达ephrin/Eph家族相关因子,与成骨细胞表面的相应的受体结合,完成骨改建。更有研究者认为,成纤维细胞生长因子作用于骨细胞,调节细胞内外的钙离子,对骨质矿化和钙盐沉积产生影响。外泌体(Exosome)是一种细胞胞外囊泡。近年来,针对外泌体参与骨组织改建的研究逐渐深入,通过各种细胞与骨细胞之间的相互作用和调控修复骨缺损,对于骨稳态及骨内环境平衡的维持具有重要意义。这些研究提示我们,在HPDLFs参与牙槽骨改建的过程中,外泌体可能影响成骨细胞的生物学功能。因此,本课题将探究HPDLFs的外泌体对成骨细胞的生物学行为的影响,为牙槽骨修复提供新的思路和理论参考。目的:原代培养HPDLFs提取外泌体,作用于成骨细胞,检测成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、成骨相关基因BGP的表达,为牙周炎病程中引起的牙槽骨丧失,提供新的理论参考。方法:第一部分人牙周膜成纤维细胞的原代培养及鉴定于川北医学院附属医院口腔科门诊,收集14-20岁患者因正畸或阻生需要拔除的健康牙齿,无菌条件下分离牙周膜,采用组织块培养法,原代培养人牙周膜成纤维细胞,显微镜下观察细胞形态,免疫组织化学方法对其进行鉴定。第二部分人牙周膜成纤维细胞的外泌体提取及鉴定构建牙周炎症模型,用10μg/ml LPS刺激HPDLFs,并收集HPDLFs和LPS-HPDLFs的培养上清液,通过超速离心法提取外泌体。对外泌体浓度进行测定。取100μl HPDLFs-EXO,用PBS稀释2倍后采用电镜观察外泌体形态,Western blot检测HPDLFs-EXO表面标志蛋白CD63及TSG101表达。第三部分人牙周膜成纤维细胞的外泌体对成骨细胞的影响HPDLFs-EXO 和 LPS-HPDLFs-EXO 作用于 hFOB 1.19 人成骨细胞,CCK-8检测细胞增殖并进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测;QPCR检测成骨相关基因BGP的表达情况,共聚焦显微镜下观察hFOB1.19人成骨细胞对HPDLFs-EXO的摄取荧光。结果:1通过组织块培养法,成功培养出原代人牙周膜成纤维细胞,并对其进行传代扩增、冻存,传代后HPDLFs生长较快,免疫组织化学方法对其进行鉴定:波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性。2得到HPDLFs-EXO和LPS-HPDLFs-EXO,电镜下观察呈圆形或椭圆形,并用Western blot检测到表面标志蛋白CD63及TSG101表达。3 CCK-8检测显示:两组外泌体均能促进hFOB1.19人成骨细胞增殖,且浓度越高,hFOB1.19人成骨细胞增殖越明显,差异具有统计学意义(P<0.01);采用相同浓度的HPDLFs-EXO和LPS-HPDLFs-EXO分别刺激hFOB1.19人成骨细胞,HPDLFs-EXO组增殖较明显(P<0.01)。碱性磷酸酶活性检测和成骨相关基因BGP检测后发现,外泌体组表达均高于空白对照组。荧光染色后观察到hFOB1.19人成骨细胞对HPDLFs-EXO的摄取。结论:1人牙周膜成纤维细胞的外泌体可以促进成骨细胞增殖,参与牙槽骨改建。2在炎症环境下,人牙周膜成纤维细胞的外泌体仍有作用,但效果低于正常环境下外泌体。3人牙周膜成纤维细胞的外泌体对成骨细胞的影响随浓度的增高而增强。