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流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科,分甲、乙、丙3个型；其中禽流感病毒(vian Influenza Virus, AIV)属于甲型,一般仅感染禽类；如果病毒在复制过程中发生基因重配,致使其结构发生改变,则获得感染人的能力,从而使得人被感染禽流感。到目前为止,能直接感染人的禽流感病毒亚型有：H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H9N2和H7N9等。据不完全统计,在众多人感染禽流感病毒的亚型中,H5N1的致死率最高。1997年,中国香港一名死于流感的3岁男孩体内首次发现并分离出能直接感染人类的禽流感病毒亚型H5N1。截止到2013年,全球共报告人感染高致病性H5N1禽流感622例,其中死亡371例；病例主要分布于15个国家,其中我国发现45例,死亡30例。目前研究普遍认为：1.H5N1的传染源为携带病毒的禽类；2.H5N1的传播途径主要包括禽—人传播、禽排泄物污染的环境—人传播、少数非持续人—人传播。鉴于H5N1的高致病性及对全球人类健康影响重大,本文主要针对H5N1展开相关研究[5]。H5N1病毒颗粒外膜由两种表面糖蛋白覆盖,一种为植物血凝素(Hemagglutinin, HA),另一型为神经氨酸酶(Neuraminidase protein, NA),HA分15个亚型,NA分9个亚型。HA约含550个氨基酸,以同源三聚体形式存在于H5N1病毒表面,能与呼吸道相关细胞表面唾液酸受体特异性结合,在介导病毒吸附、穿膜以及刺激机体产生中和性抗体等方面起到重要作用；此外,HA的可裂解性是H5N1亚型禽流感病毒组织嗜性的关键因素,因为只有HA前体被宿主细胞的蛋白酶裂解后,流感病毒才具有感染性。因此,HA的这两大特殊性质决定了其在H5N1高致病性及在疾病的诊断和防治技术研究的重要地位。NA则可清除呼吸道上皮细胞表面的唾液酸,协助HA使禽流感病毒得以侵入上皮细胞。密码子是mRNA链上决定一个氨基酸的相邻三个碱基,与基因表达调控密切相关。外源基因mRNA密码子构成决定着外源基因在宿主中表达量。真核系统和原核系统偏爱的密码子不同,当我们用原核系统表达真核基因时,真核基因中的部分密码子对于原核系统来说可能是稀有密码子,导致外源基因表达效率和表达水平很低。有研究通过对H5N1亚型AIV的HA基因进行生物信息学分析后发现,HA完整ORF序列中含有大量稀有密码子,且部分稀有密码子相距很近,甚至出现相邻并列的情况,这些均不利于HA在大肠杆菌中的成功表达。但有研究表明,一种称为Rosetta菌株通常可有效提高含有大量稀有密码子的目的基因表达。Rosetta宿主菌是BL21衍生菌,能明显增强携带大量大肠杆菌稀有密码子的真核基因的表达；该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs[11];这样Rosetta菌株实现了“万能”的翻译。故本研究由采用该菌株来表达HA基因,从而克服了HA蛋白不易提纯、产量低、价格昂贵等问题,为我们深入研究H5N1亚型AIV提供支持。本研究根据GenBank上公布的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因序列设计引物(HA基因来自北京军事科学医学院提供的pcDNA3.1-H5N1-HA),运用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因。用Xho I和BamH I双酶切后,获得全长HA基因,将HA基因分别与酶切的pET-32a(+)连接,构建原核表达载体pET-32a (+)-HA,经酶切和测序鉴定后转化到宿主大肠杆菌Rosetta. Gami B(DE3)中,经IPTG诱导,运用SDS-PAGE方法鉴定表达蛋白,发现HA基因获得大量表达,重组HA蛋白以包涵体的形式存在。液相芯片,又称为微球体悬浮芯片(suspension array, liquid chip),是基于xMAP (flexible Multi Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术,具有高通量、灵活快速、精确、重复性好、操作方便等众多优点,可用于蛋白质和核酸等生物分子高通量的检测。液相芯片技术基本原理是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光信号来达到定性和定量的目的,通常一个反应孔内可以完成近100多种不同生物学反应。荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)[14]是一种基于普通PCR技术创建的一种通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。它的作用机制为在PCR进程中,随着产物的积累,荧光信号的强度等比加强,根据荧光强度的变化即可监测产物量的变化。该项技术最大特点为特异性强、灵敏度高、操作简便、快速高效。qPCR技术应用范围极为广泛,其中包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等；同时它也可以广泛应用于临床医学,如针对常见病原体定量检测,从而做到早发现早诊断早治疗。本实验运用qPCR来检测IP-10在mRNA水平的表达情况。细胞因子是细胞应对各类刺激而分泌的小分子蛋白,可介导并调控细胞的生长与分化、组织的发育与修复等多种生命过程,同时在人体对疾病的免疫调节、炎症应答、肿瘤发生和转移等病理过程中起着重要的作用。细胞因子的改变与疾病特异性损害的程度相关,因此,在评价一些疾病活动程度中显得非常重要。综上,本研究运用该项技术来检测HA蛋白刺激正常人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial cells,16HBE)后细胞上清中细胞因子及趋化因子的变化,进而鉴定出HA蛋白生物活性。近来研究认为,体内病毒载量过高及过度的炎症反应造成免疫病理损伤是AIV主要的致病机制。AIV通过其表面膜蛋白-血凝素(Hemagglutinin protein,HA)与呼吸道上皮细胞如正常人支气管上皮细胞的相应受体结合而感染侵入细胞,这一过程诱导了细胞因子及趋化因子的大量释放,进而活化并募集巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞至感染部位,导致严重的弥漫性肺泡损伤,引起一个类似急性呼吸窘迫综合症的病理生理改变以及继发的全身多器官免疫炎症性反应。然而迄今为止,缺乏针对这种免疫损伤的特效治疗药物,为此本研究试图在接受HA蛋白刺激后的16HBE所分泌的各种细胞因子及趋化因子中找出影响H5N1亚型AIV高致病性的相关细胞因子及趋化因子,进而探索出一种通过抑制相关细胞因子的分泌达到降低H5N1亚型AIV高致病性的新途径。通过以上研究,我们得出以下结果：(1)通过酶切和测序鉴定,证明成功构建重组表达质粒pET-32a(+)-HA。(2)运用氯化钙法成功制备了Rosetta.gami B(DE3)菌株感受态。(3)pET-32a(+)-HA转化到Rosetta.gami B(DE3)菌株中,IPTG诱导下产生的蛋白大小在66.0kDa-90.0kED之间,筛选pET-32a(+)-HA(DE3)大量诱导的最佳表达条件为,诱导温度25℃,IPTG终浓度为0.5mM,诱导时间为2h、4h、8h、过夜,通过SDS-PAGE电泳分析,IPTG诱导时间对HA ORF目的蛋白的表达量无明显影响。(4)发现重组HA蛋白以包涵体的形式存在,通过SDS-PAGE电泳分析,诱导表达菌体超声波沉淀物在66.0kDa-90.0kDa之间处出现大量与预期目的一致的表达产物堆积,而上清及未诱导对照在该位置未发现有目的表达产物出现。(5)通过使用变性增溶剂,加能促进蛋白质打开二硫键的二硫苏糖醇(DTT),使包涵体蛋白变为可溶性蛋白,从而方便表达产物经Ni-NTA纯化柱得到纯化蛋白,SDS-PAGE分离蛋白复合物的电泳结果显示,纯化HA蛋白中非特异性的蛋白较少。(6)利用液相芯片技术检测细胞上清中细胞因子及趋化因子的变化,结果显示,HA蛋白刺激正常人支气管上皮细胞,在16HBE细胞培养的上清中IL-6、IL-8、GM-CSF与对照组比较表达明显升高,且具有统计学意义。(7)不同浓度梯度的重组HA蛋白刺激16HBE细胞2h后,提取总RNA,运用荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测IP-10基因的表达。综上所述,本研究首先成功地构建了重组表达质粒pET-32a(+)-HA,再次通过生物信息学分析人的HA基因编码区含有大量影响蛋白表达的大肠杆菌稀有密码子,因此选择了对稀有密码子表达效应较好的菌株Rossetta(DE3)。该实验成功地将HA基因的全编码区克隆进表达载体并通过优化实现了HA基因在大肠杆菌中的表达,运用SDS-PAGE电泳分析发现表达的目的蛋白相对分子量与预期相符合,且非特异性蛋白较少,利用液相芯片技术检测接受HA蛋白刺激的16HBE细胞上清中细胞因子及趋化因子的变化,进而鉴定重组蛋白的生物活性。这不仅为进一步研究禽流感病毒HA蛋白的性质、致病机制等方面的研究提供实验数据,而且也为深入研究人感染高致病性禽流感的发病机制及其防治策略提供了新的机遇。