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膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性等方面都扮演着重要的角色。由于膜蛋白在天然生物体中的数量非常低,异源表达的膜蛋白经常表达量较低或者无活性,膜蛋白的过表达可能对细胞有毒性,并且在纯化时很难选择合适的溶解试剂,所以对膜蛋白的结构和功能的研究还远不及可溶性蛋白质。本研究通过构建的新型载体研究一种未知膜蛋白,可以很好的解决上述问题。
本研究从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析结果表明该序列全长833 bp,由558 bp的ORF、102 bp的5’端非翻译区和173 bp的3’端非翻译区组成,其编码的185个氨基酸具有四个跨膜区,预测分子量大小为20.94 kD,等电点7.38。同源性比对结果表明,该序列与其他物种之间的同源性很低,本身也不存在任何的保守结构域,因此该基因可能是家蚕中首次发现的新编码膜蛋白的基因,将其命名为BmTmC27。通过PCR方法扩增获得家蚕BmTmC27的ORF序列,将其插入载体pBacPAK8-polh,构建重组质粒pBaePAK8-polh-BmTmC27,然后将重组基因polh-BmTmC27分别插入原核表达载体pGEX-4T-1和Bac to Bac系统的转移载体pFastBacHTB。重组质粒pGEX-4T-1-polh-BmTmC27转化表达载体大肠杆菌BL21(DE3),经终浓度1 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白Polh-BmTmC27,SDS-PAGE分析结果表明该重组蛋白获得成功表达;然后利用多角体蛋白溶于碱性溶液的性质,采用调节pH的方法纯化重组蛋白Polh-BmTmC27。将重组转移载体pFastBacHTB-polh-BmTmC27转化含有BmNPV bacmid的大肠杆菌DH10Bac,通过转座重组将目的片段插入Bacmid DNA,重组病毒DNA采用脂质体介导法转染家蚕培养细胞,经SDS-PAGE电泳和Westhem Blotting检测分析,polh-BmTmC27在家蚕细胞中成功表达。为了解该基因在家蚕各组织中的表达情况,通过荧光定量PCR实验对其转录水平进行分析,结果显示在五龄幼虫的各组织中,脂肪体转录最高,而头中最少,表达水平差异显著。利用GST-沉降技术研究与Polh-BmTmC27蛋白相互作用的蛋白,结果表明在家蚕细胞中可能存在一种钙粘连蛋白与BmTmC27发生相互作用。RNAi和流式细胞仪检测结果表明BmTmC27基因被干扰后可能会促使BmN细胞停留在G0/G1期。