油菜RNAi载体的构建与转基因研究

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RNAi技术是研究基因功能组学的新的增长点,在植物方面现已广泛应用于植物转基因研究和植物抗病性研究等。它和传统的基因功能研究方法相比具有高特异性、系统性、高效性、操作简便、用量低等明显的优点,因而倍受基础研究人员和应用人员的青睐。农杆菌介导的基因转化与其它的植物转基因方法相比具有以下优点:方法已经比较成熟;转基因多是单拷贝或低拷贝数插入,并且优先插入转录活性区域;再生植物可育;方法简单,费用低。进行植物的RNAi需具备以下两个条件:一是构建RNAi需要的双元载体;二是具备被干扰基因的再生组培体系。本文在构建RNAi高通量双元载体和被干扰基因的再生组培体系方面进行了探索。通过PCR技术克隆一系列RNAi高通量双元载体所需要的元件并进行组装。  反向重复片段两个:胭脂碱合成酶基因终止信号(nos),绿色荧光蛋白基因(gfp),启动子:花椰菜花叶病毒启动子(CamV35S),终止子:胭脂碱合成酶基因终止信号(nos),报告基因:绿色荧光蛋白基因(gfp),葡萄糖苷酶基因(gus),目的填充片段兼抗性标记基因:氨基糖苷3-腺苷酰基转移酶基因(aadA)。   本实验以油菜的子叶柄为外植体系统探索了适合本品种的再生条件。结果表明:以附加20.0g/L的蔗糖和8.0g/L琼脂的MS培养基为基本培养基,子叶柄可以在6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L的诱导培养基上很好的形成愈伤组织,在附加6-BA6.0mg/L的分化培养基上约40%的愈伤组织产生不定芽。尝试用农杆菌介导的方法把基因gfp和gus转入甘蓝型油菜。   本研究的下一步工作就是验证gfp和gus的油菜转化植株并将构建的RNAi高通量双元载体转入油菜的转基因植株,成功以后即可构建油菜的RNAi文库。
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