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Dishevelled是机体组织细胞中广泛存在的一种蛋白，具有多功能和进化上高度保守的特点。从低等生物水螅、线虫、爪蟾，到哺乳动物小鼠和人都发现存在Dishevelled基因，并且在哺乳动物中已确定3个Dishevelled(Dvl)基因。Dishevelled蛋白作为‘Wnt信号传导通路的成员之一，是Wnt信号通路中一个非常关键的调节点，不但调节了Wnt信号通路，而且还跟其它多条信号通路中的蛋白质分子有相互作用，成为Wnt信号通路与其它信号之间发生交叉作用(Cross-talk)的桥梁。NF-κB是细胞中重要的转录因子，几乎存在于所有细胞中。在经典的信号途径中，在静息状态下，细胞质中由p65和p50结合形成的NF-κB与抑制蛋白IκBα相结合，信号下游的基因转录事件处于抑制状态。当信号来临时，IκBα被磷酸化进而泛素化，随后被蛋白水解酶体降解，从而释放NF-κB。释放的NF-κB进入细胞核并结合到DNA结合位点上调节多种基因的表达，涉及多种生物学过程，包括免疫应答，炎症反应，淋巴细胞的发育和增殖，肿瘤的转化、增殖和转移等。可想而知，如此重要的信号途径在体内是需要被严格调控的，而失去控制的NF-κB活性与癌症及免疫失调密切相关。 实验室在以往的工作中，以Dvl-1的一个片段(命名为Dvl-1-C1)作为“诱饵”进行酵母双杂交，筛选到了NF-κB信号途径的中心分子p65。本论文的第一部分就是基于这样的线索，探讨Dvl与p65可能存在的联系。首先，利用在293T细胞中过表达外源的Dvl和p65的免疫共沉淀验证了两者的相互作用。接下来在大肠杆菌中表达纯化Dvl片段和p65片段，发现两者存在直接的相互作用。进一步，发现在报告基因系统中过表达Dvl能抑制TNF-α和p65引起的NF-κB活性。而RNAi(RNA interference，RNA干扰)下调内源Dvl，TNF-α介导的NF-κB报告基因活性有所上调。过表达或RNAi Dvl同样可以引起一系列NF-κB下游靶基因的转录水平发生变化，这些都提示了Dvl可能参与调节了NF-κB活性，是NF-κB信号途径中一个新的负调节因子。接着，继续探索Dvl抑制NF-κB信号通路的分子机制，结果发现Dvl并不依赖Wnt信号，也不通过一些已知的NF-κB抑制因子，诸如β-catenin，p53等，而是以一种未知的方式对NF-κB发挥一个显著的抑制效应。进一步，发现TNF-α诱导的IκBα的降解以及p65的入核都不受Dvl的影响，Dvl和p65的结合只发生在核里，RNA干扰Dvl之后结合在NF-κB靶基因启动子区的p65有所增加，这表明Dvl可能是在核里通过影响p65与DNA的结合能力而发挥它的抑制效应。已知NF-κB可以抑制细胞凋亡，工作显示过表达Dvl能促进TNF-α引起的细胞凋亡，而RNAi Dvl则进一步抑制细胞凋亡。综合以上工作，得出这样一个结论：Dvl作为一个新的NF-κB调节因子，通过影响结合在DNA上的p65从而抑制NF-κB信号活性，并有可能通过抑制NF-κB活性从而促进细胞凋亡。 蛋白激酶基因的数量在人类基因大家族中占据的份额约为1.7％，而人体细胞中约30％蛋白质受到蛋白激酶的调控。通过对底物活性的调节，激酶几乎调节着生命活动的所有过程，包括细胞分化、凋亡、迁移、细胞周期、骨架重排、细胞代谢以及基因转录等。目前我们实验室已经建立了一个针对人类蛋白激酶家族的RNAi功能筛选系统，具体地说，就是针对大量的人类蛋白激酶基因构建了相应的基于DNA表达载体的siRNA表达质粒，并在体外验证其能有效地降低相应的激酶表达水平。有了这样一个蛋白激酶RNAi库，就可以在一系列研究系统中去对激酶进行规模性功能筛选。 本论文的第二部分工作是以NF-κB信号通路为研究对象，结合人类激酶组RNA干扰库，在报告基因系统中筛选TNF-α信号刺激下可能参与到NF-κB信号通路中的未知激酶。筛选结果显示，经过RNA干扰，在200多个激酶中，有62个激酶RNA干扰后影响TNF-α刺激的NF-κB活性。在这62个激酶中，其中9个激酶RNA干扰后NF-κB活性增强，53个激酶RNA干扰后NF-κB活性受到一定抑制。在这些筛选得到的对NF-κB活性可能有调控的激酶中，绝大部分未经报道参与NF-κB信号途径的调节，对这些激酶在NF-κB信号途径中的新功能的深入研究，将有助于我们进一步完善NF-κB信号及其网络调控的相关机制。