重组人CXCR1腺病毒的构建

来源 :重庆医科大学 重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dishunzhaopin
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CXCR1是只含有一条肽链的糖蛋白,为α亚族趋化性细胞因子受体。CXCR1可与IL-8特异性结合,介导细胞信号转导的启动,通过信号传导过程,决定相应配体趋化功能的实现,与细胞的活化、增殖、迁徙及刺激血管形成和释放血管形成前体物质等有关,因此CXCR1涉及到多种疾病的发生发展。为进一步研究CXCR1在人体中各种疾病的发生发展中的作用,我们构建CXCR1基因腺病毒表达载体,使得CXCR1基因在细胞内得以表达。目的:应用AdEasy腺病毒载体构建人CXCR1基因的重组腺病毒pAd-CXCR1。方法:1.根据GenBank已收录的CXCR1cDNA全长设计引物并送合成,采用PCR方法扩增CXCR1基因。2.将目的基因的扩增片段克隆至穿梭质粒pAdTrace,构建穿梭质粒pAdTrace-CXCR1,并用KpnI和HindIII双酶切进行鉴定。3.PemI酶切pAdTrace-CXCR1使之线性化,用电转化法将线性质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转入BJ5183细菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CXCR1。4.重组腺病毒用酶切及PCR方法进行鉴定。5.重组腺病毒质粒用PacI线性化后转染HEK-293细胞,进行腺病毒的包装,并在HEK-293细胞中进行腺病毒扩增。结果:通过腺病毒构建系统及酶切、连接、转化等技术,成功的构建了穿梭质粒pAdTrace-CXCR1。将线性化的穿梭质粒质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1于BJ5183细菌内进行同源重组,最终成功构建重组腺病毒质粒pAd-CXCR1。将pAd-CXCR1质粒于HEK-293细胞内扩增,得到高滴度人CXCR1基因的腺病毒载体。结论:成功构建了人CXCR1基因的腺病毒载体,得到高滴度的腺病毒,为进一步研究CXCR1蛋白的生物功能及其在临床各种相关疾病中的作用奠定了基础。
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