【摘 要】
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目的探讨碳青霉烯类药物耐药的产酸克雷伯菌的耐药表型、耐药基因型、菌株同源性以及其移动元件介导的耐药机制,为预防和控制碳青霉烯类耐药菌株的传播提供循证依据。方法2013年2月至2019年9月期间,收集10家医院（滨州,聊城,莱芜,浙江,青岛,东营,郑州,济宁,深圳,天津）住院患者分离的24株非重复碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌。采用生物梅里埃Vitek-2 Compact系统对收集的菌株进行重新鉴定和
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目的探讨碳青霉烯类药物耐药的产酸克雷伯菌的耐药表型、耐药基因型、菌株同源性以及其移动元件介导的耐药机制,为预防和控制碳青霉烯类耐药菌株的传播提供循证依据。方法2013年2月至2019年9月期间,收集10家医院（滨州,聊城,莱芜,浙江,青岛,东营,郑州,济宁,深圳,天津）住院患者分离的24株非重复碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌。采用生物梅里埃Vitek-2 Compact系统对收集的菌株进行重新鉴定和药敏试验;用聚合酶链式反应（PCR）筛选菌株是否携带常见的碳青霉烯酶基因;利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和Bio Numerics（7.6）软件分析菌株之间的克隆聚集性;S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）检测菌株携带质粒的数量和大小;首先基于二代Mi Seq和/或三代Min ION测序平台获取菌株的基因组序列,然后使用BLAST、Res Finder、ISFinder、the Tn Number Registry和INTEGRAL等软件分析菌株携带的耐药基因和质粒上的移动元件信息;菌株携带的质粒基因结构图绘制使用Inkscape0.48.1软件。结果24株产酸克雷伯菌药敏显示对多种抗菌药物耐药,除了对氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢曲松、厄他培南、亚胺培南和美罗培南100%耐药外,对哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶的耐药率分别为87.50%,91.67%,50.00%,58.33%和54.17%,但对阿米卡星和呋喃妥因耐药率相对较低。经PCR扩增常见的碳青霉烯酶基因和对扩增产物的测序比对,结果显示:有18株菌携带blaNDM-1基因,5株携带blaKPC-2基因,1株携带blaNDM-1和blaKPC-2两种碳青霉烯酶基因,分别占75.00%,20.83%和4.17%。高通量测序及比对结果表明,这24株菌还可检测到氨基糖苷类、喹诺酮类和其他β-内酰胺类等抗生素耐药基因。PFGE和MLST结果分别显示24株产酸克雷伯菌可分成9个克隆群（A～I）和10种ST型（ST2、ST27、ST43、ST52、ST81、ST84、ST92、ST137、ST145、ST210）,聚类分析（Bio Numerics7.6）显示菌株间相似度为61.2～100.0%;另外,这24株菌中,产酸克雷伯菌滨州株（KOX1～KOX5）PFGE条带位置和数目几乎一致,仅有一条带有差异,菌株间相似度为95%,且这些菌株都属于ST43型;产酸克雷伯菌郑州株（KOX16～KOX18）之间的相似度为92.7%～95.5%,均为ST137型;而产酸克雷伯菌天津株（KOX21～KOX23）之间的相似度100%,均为ST2型。上述结果结合患者的临床资料综合分析,表明在三所医院中存在医院感染的克隆聚集。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳结果显示,每株菌可携带的质粒数量介于1～6个不等,最大为250Kb左右,同时有12株菌分别携带了<20Kb的质粒。二代和三代测序获得了产酸克雷伯菌KOX1株的染色体和携带的三个质粒的全序列（测序获得的3个质粒的大小与S1-PFGE显示的大小相符合）,将携带blaNDM-1基因的质粒命名为p NDM-KOX1。生物信息分析显示质粒p NDM-KOX1的G+C平均含量为52%,长度为174,008bp,含有229个开放阅读框架（ORF）。根据质粒的复制子rep A,该质粒属于2型Inc C不兼容群,其MDR（多重耐药）区由chr A区、转座单元IS26-mph（A）-mrx-mph R（A）-IS6100、截短的转座子ΔTn1548和ΔTn125组成。chr A区中的IRLchr A结构由于插入序列IS5075的插入被打断成为两部分;转座单元IS26-mph（A）-mrx-mph R（A）-IS6100由于插入序列IS6100介导而位于chr A区的下游且成反方向;质粒中转座子ΔTn1548部分由于arm A基因丢失和ISEc29截短而不完整;转座子ΔTn125携带了blaNDM-1基因。结论产酸克雷伯菌呈现多重耐药与其携带多种耐药基因有关。携带blaNDM-1或bla KPC-2基因是产酸克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的主要机制。ST43、ST137和ST2型产酸克雷伯菌在三所医院存在克隆聚集。经检索,携带blaNDM-1基因的ST43型和ST137型产酸克雷伯菌引起的医院感染暴发属国内外首次报道。因此,有必要进一步加强耐药菌的监测,预防碳青霉烯类耐药产酸克雷伯菌的流行和暴发。
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