论文部分内容阅读
研究背景与目的： 肺癌是目前人类发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌的主要病理类型包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的80％～85%。导致非小细胞肺癌临床治疗失败和患者死亡的主要原因之一是肿瘤的侵袭和转移。因此，深入研究非小细胞肺癌转移过程的分子机制，寻找新的生物标记物和治疗靶标，是当前肿瘤研究领域的重要课题。 MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链 RNA，通过碱基互补配对方式结合到靶基因mRNA的3’UTR，对靶基因mRNA进行降解或者翻译抑制，实现对靶基因表达水平的转录后调控。目前人类基因组中已确认的miRNA有2578个，可能参与人类30%的蛋白表达调控，影响着几乎所有的信号通路，与生长发育以及许多疾病的发生发展息息相关。在肿瘤中，异常表达的miRNAs通过靶向癌基因或抑癌基因，发挥着类似抑癌基因或癌基因的作用，参与癌变进程的每一阶段，包括肿瘤的侵袭和转移。 为筛选与非小细胞肺癌转移相关的因子，本研究利用免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting，MACS)技术从人肺腺癌细胞株A549细胞中分选出CD133阳性和CD133阴性A549细胞株；利用miRNA PCR芯片和肿瘤转移相关基因芯片从分选后未经培养的两株原代细胞中筛选出差异表达的 miRNAs和差异表达的转移相关基因；应用生物信息学技术对差异5倍以上的miRNAs进行靶基因预测，再将预测得到的靶基因与差异表达的转移相关基因进行比对。结果发现，在CD133阳性A549细胞表达明显下调的7个miRNA中，microRNA-29b(miR-29b)的靶基因与转移基因芯片中的差异基因交集最多，为4个。与CD133阴性细胞相比，CD133阳性A549细胞中miR-29b表达下调了7.6倍，4个交集靶基因PTEN、ETV4、COL4A2、MMP2上调了1.11至4.20倍。由此，我们选择miR-29b作为非小细胞肺癌转移相关的候选miRNA，对miR-29b在非小细胞肺癌转移中的作用及其分子调控机制进行研究，选择与转移密切相关的MMP2和PTEN进行后续靶基因的验证，以期为基于miRNA的非小细胞肺癌的临床诊治工作提供科学依据。 研究方法： 1、非小细胞肺癌转移相关miRNAs的筛选及表达验证 （1）利用miRNA PCR芯片从CD133阳性和CD133阴性A549细胞中筛选出差异miRNAs表达谱。以差异倍数＞5的miRNAs为检索词，利用三个常用数据库MicroRNA.org、Targetscans和Pictar对其靶基因进行预测，挑选出3个软件交集的靶基因，再与通过肿瘤转移相关基因芯片得到的两株细胞间差异表达的转移相关基因进行比对，筛选与非小细胞肺癌转移相关miRNAs。 （2）利用实时荧光定量PCR的方法检测miR-29b在非小细胞肺癌癌组织、配对癌旁组织和非小细胞肺癌细胞株中的表达情况，统计分析miR-29b表达与非小细胞肺癌临床病理特征的相关性。 2、miR-29b对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 （1）利用表达miR-29b的慢病毒载体或对照慢病毒载体感染A549细胞，96孔板有限稀释法挑选阳性单克隆，建立稳定过表达 miR-29b的非小细胞肺癌细胞株和对照细胞株。采用反复Transwell分离高低转移能力的非小细胞肺癌细胞株A549-H和A549-L。利用阳离子脂质体法，将miR-29b mimic瞬时转染至内源性低表达miR-29b非小细胞肺癌细胞株A549-H中。利用CCK-8法、Transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验检测过表达miR-29b对非小细胞肺癌细胞A549和A549-H生长、迁移及侵袭能力的影响；裸鼠皮下成瘤实验检测稳定过表达miR-29b的非小细胞肺癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。 （2）利用阳离子脂质体法，将miR-29b inhibitor瞬时转染至内源性高表达miR-29b非小细胞肺癌细胞株H460和A549-L中，利用CCK-8法、Transwell小室迁移实验及Boyden小室侵袭实验检测抑制miR-29b对非小细胞肺癌细胞H460和A549-L生长、迁移及侵袭能力的影响。利用表达miR-29b inhibitor的慢病毒载体或对照慢病毒载体感染 H460细胞，经流式细胞仪分选建立稳定抑制miR-29b表达的非小细胞肺癌细胞株和对照细胞株。裸鼠皮下成瘤实验检测稳定抑制miR-29b表达的非小细胞肺癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。 3、miR-29b靶基因的鉴定 （1）分别构建融合MMP2、PTEN基因野生型和突变型3’UTR的荧光素酶报告基因载体，应用荧光素酶报告检测系统对miR-29b与MMP2、PTEN相互作用进行验证。 （2）利用阳离子脂质体法，将miR-29b mimic或miR-29b inhibitor瞬时转染至非小细胞肺癌细胞株中，利用实时荧光定量PCR和Western blot检测过表达和抑制miR-29b对MMP2、PTEN mRNA和蛋白表达水平的影响，并对miR-29b和MMP2在非小细胞肺癌细胞中的表达进行相关性分析。 4、miR-29b上游转录因子的预测和鉴定 通过 Ensembl数据库在线获取 miR-29b基因上游启动子序列，利用四个常用数据库Proscan、Consit、TFSEARCH及TRED预测及分析可能与miR-29b启动子结合的转录因子。构建过表达转录因子的质粒载体和融合miR-29b启动子序列的荧光素酶表达载体，利用荧光素酶报告检测系统检测转录因子对 miR-29b启动子转录活性的影响。利用阳离子脂质体法，将过表达转录因子的质粒转染至非小细胞肺癌细胞株中，利用实时荧光定量PCR和Western blot检测转录因子对miR-29b和MMP2表达水平的影响。 研究结果： 1、非小细胞肺癌转移相关miRNAs的筛选及表达验证 （1）与CD133阴性细胞相比，CD133阳性A549细胞表达差异达两倍或以上的 miRNAs有51个，差异倍数＞5的有10个 miRNAs，分别是表达下调的has-miR-337-3p，has-miR-33a，has-miR-32，has-miR-374b，has-miR-29b，has-miR-559，has-miR-219-5p和表达上调的 has-miR-1，has-miR-512-5p，has-miR-639。通过三个常用数据库预测7个表达下调 miRNA的靶基因，发现has-miR-29b的4个靶基因包含在 CD133阳性和CD133阴性A549细胞之间差异表达的转移相关基因中，CD133阳性A549细胞中miR-29b表达下调了7.6倍，靶基因PTEN、ETV4、COL4A2、MMP2等上调了1.11至4.2倍。于是，我们选定hsa-miR-29b作为研究对象，选择与转移密切相关的MMP2、PTEN进行靶基因的鉴定。 （2）实时荧光定量PCR检测结果显示，在20对配对非小细胞肺癌石蜡组织中，癌组织中miR-29b的表达显著低于癌旁肺组织(P=0.001，t=-3.817)；miR-29b在10例新鲜非小细胞肺癌组织的表达显著低于配对癌旁肺组织(P<0.001，t=-9.016)。以永生化的人支气管上皮细胞16HBE为对照，miR-29b在9种非小细胞肺癌细胞株中的表达具有显著性差异(F=99.444，P<0.001)；与16HBE细胞比较，miR-29b在 PAa、PGCL3、H520、A549、H1299、95D等6种细胞株中的表达显著降低(P=0.002；P=0.001；P=0.001；P=0.000；P=0.000；P=0.000)；在H460细胞中的表达显著高于其他8种非小细胞肺癌细胞株(P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000；P=0.000)。miR-29b在30例非小细胞肺癌组织中的表达与患者年龄、性别、组织学分型以及肿瘤分化程度均无显著性相关(P=0.578；P=0.862；P=0.625；P=0.891)，与临床分期和有无淋巴结转移有显著性相关(P=0.004；P=0.031)，Pearson相关分析显示，miR-29b表达与有无淋巴结转移呈负相关(r=-0.547，P=0.043)。 2、miR-29b对非小细胞肺癌细胞生物学行为的影响 2.1 miR-29b过表达对非小细胞肺癌细胞体内外生物学行为的影响 （1）建立了稳定过表达 miR-29b的非小细胞肺癌细胞株A549-miR-29b-Clone2和对照细胞株 A549-NC。实时荧光定量 PCR检测结果表明，A549-miR-29b-Clone2细胞株中miR-29b的表达显著高于 A549细胞(P<0.001)，而A549-NC细胞株中miR-29b的表达与A549细胞相比没有显著性差异(P=0.945)。 （2）采用反复 Transwell实验获得了高低转移能力的非小细胞肺癌细胞株A549-H和A549-L。在体外迁移和侵袭实验中，A549-H细胞穿过小室膜的细胞数目明显多于 A549-L细胞(t=-32.220，P<0.001；t=-28.461，P<0.001)。A549-H细胞中miR-29b的表达显著低于A549-L细胞(P=0.001)。相对于Blank组与NC组，A549-H细胞组在转染miR-29b mimic后miR-29b表达显著升高(P=0.044，P=0.044)。 （3）采用CCK-8法检测miR-29b对细胞体外增殖能力的影响，结果发现，与A549和A549-NC细胞组相比，稳定过表达miR-29b的A549-miR-29b-Clone2细胞组的增殖能力显著降低(F=124.596，P<0.001)。同样，与Blank组与NC组相比，A549-H细胞组在转染miR-29b mimic后增殖能力显著降低(F=10.343，P<0.001)。说明过表达miR-29b可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。 （4）Transwell小室迁移实验检测细胞体外迁移运动能力的变化，结果发现与A549和A549-NC细胞组相比，A549-miR-29b-Clone2细胞组穿过膜的细胞数目显著减少(F=31.613，P<0.001)。同样，与Blank组与NC组相比，A549-H细胞在转染miR-29b mimic后迁移运动能力显著降低(F=103.302,P<0.001)。Boyden小室侵袭实验分析细胞体外侵袭能力的变化，结果发现，与 A549和A549-NC细胞组相比，A549-miR-29b-Clone2细胞穿过基质胶的细胞数目显著减少(F=347.905，P<0.001)。同样，与 Blank组与 NC组相比，A549-H细胞在转染miR-29b mimic后侵袭能力显著降低(F=145.361,P<0.001)。说明过表达miR-29b可以抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。 （5）裸鼠皮下成瘤实验结果表明，与 A549和A549-NC细胞组相比，A549-miR-29b-Clone2细胞组裸鼠皮下瘤体重量显著减轻(Welch=24.125，P<0.001)，肿瘤生长速度显著减慢(F=29.782，P<0.001)，体积也显著缩小(F=58.302，P<0.001)。说明miR-29b在体内可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和成瘤能力。 2.2miR-29b inhibitor对非小细胞肺癌细胞体内外生物学行为的影响 （1）与Blank组与NC组比较，瞬时转染miR-29b inhibitor后H460和A549-L细胞内的miR-29b的表达量显著下降(F=10.176，P=0.012；F=7.321，P=0.025)。 （2）采用CCK-8法检测miR-29b抑制后H460和A549-L细胞体外增殖能力的改变，结果发现，与Blank组与 NC组细胞比较，miR-29b抑制后的H460和A549-L细胞增殖速度显著加快(F=86.935，P<0.001；F=80.856，P<0.001)。说明抑制miR-29b能促进非小细胞肺癌细胞的体外增殖。 （3）Transwell小室迁移实验检测miR-29b抑制后细胞体外迁移运动能力的变化，结果发现，与Blank组与NC组细胞比较，miR-29b抑制后的H460和A549-L细胞穿过膜的细胞数显著增加(F=44.107，P<0.001；F=463.750，P<0.001)。Boyden小室侵袭实验分析miR-29b抑制后细胞体外侵袭能力的变化，结果发现，与Blank组与NC组细胞比较，miR-29b抑制后的H460和A549-L细胞穿过基质胶的细胞数显著增加(F=30.898，P<0.001；F=9.413，P<0.001)。说明抑制miR-29b能促进非小细胞肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力。 （4）建立了稳定抑制 miR-29b表达的非小细胞肺癌细胞株 H460-miR-29b-inhibitor和对照细胞株 H460-NC。裸鼠皮下成瘤实验结果表明，与 H460和H460-NC细胞组相比，H460-miR-29b-inhibitor细胞组裸鼠皮下瘤体重量显著增加(Welch=16.773，P=0.002)，肿瘤生长速度显著增快(F=41.778，P<0.001)，体积也显著增大(F=17.267，P<0.001)。说明miR-29b抑制后可以增强非小细胞肺癌细胞在体内的增殖和成瘤能力。 3、miR-29b靶基因的鉴定 （1）成功构建了融合 MMP2及 PTEN基因野生型和突变型3’UTR的psiCHECK-2-MMP23’UTR与psiCHECK-2-Mut-MMP23’UTR载体、psiCHECK-2-PTEN3’UTR与psiCHECK-2–Mut1-3-PTEN3’UTR载体。 （2）在转染MMP2基因野生型3’UTR载体实验组中，miR-29b mimic组与Blank组、NC组相比荧光素酶活性均显著降低(P=0.023，P=0.018)；在转染MMP2基因3’UTR突变载体的实验组中，miR-29b mimic组与blank组、NC组相比荧光素酶活性无显著差异(P=0.166，P=0.111)，说明miR-29b能与MMP2基因3’UTR直接结合，从而抑制了荧光素酶的活性。 （3）在转染PTEN基因野生型3’UTR载体的实验中，miR-29b mimic组与Blank组、NC组相比，荧光素酶活性均显著降低(P=0.000，P=0.031)；在转染psiCHECK-2-Mut-1-PTEN3’UTR或psiCHECK-2-Mut-2-PTEN3’UTR载体的实验中，miR-29b mimic组与Blank组、NC组相比，荧光素酶活性均显著降低(P=0.000，P=0.000；P=0.000，P=0.000)，在转染psiCHECK-3-Mut-3-PTEN3’UTR载体的实验中，miR-29b mimic组与Blank组、NC组相比，荧光素酶活性没有显著改变(P=0.540，P=0.238)，说明miR-29b可以和野生型PTEN3’UTR两个结合位点直接结合从而抑制荧光素酶活性。 （4）与 A549-NC细胞和A549细胞相比，稳定过表达 miR-29b的A549-miR-29b-Clone2细胞中MMP2 mRNA表达显著降低(F=19.372，P=0.002)，MMP2蛋白表达也明显下调(F=146.189，P<0.001)；A549-H细胞转染 miR-29b mimic后，与 NC组相比，细胞中miR-29b的表达显著升高(P<0.001)，MMP2 mRNA表达显著降低(P=0.048)，MMP2蛋白表达也明显下调(P<0.001)。H460和A549-L细胞在miR-29b inhibitor转染后，与Blank组和NC组相比，细胞中miR-29b的表达显著降低(F=10.176，P=0.012；F=7.321，P=0.025)，MMP2 mRNA表达显著升高(F=48.327，P=0.001；F=59.997，P=0.001)，MMP2蛋白表达也明显上调(F=59.997，P=0.001；F=25.384，P=0.018)。说明miR-29b可负调控MMP2的表达。 （5）与 A549-NC细胞和A549细胞相比，稳定过表达 miR-29b的A549-miR-29b-Clone2细胞中PTEN mRNA和蛋白表达无显著差异(F=4.835，P=0.056；F=1.041，P=0.409)；A549-H细胞转染miR-29b mimic后，与Blank组和NC组相比，细胞中PTEN mRNA和蛋白表达也没有显著差异(F=0.320，pP=0.738；F=3.599，P=0.173)。H460和A549-L细胞在miR-29b inhibitor转染后，与 Blank组和NC组相比，细胞中PTEN mRNA和蛋白表达均无有显著差异(F=0.541，P=0.608；F=1.142，P=0.380；F=1.179，P=0.370；F=3.040，P=0.196)。但过表达miR-29b可使A549和A549-H细胞中PTEN蛋白表达出现下调趋势，反之，抑制内源性miR-29b表达则可H460和A549-L细胞中PTEN蛋白表达出现上调趋势。 （6）实时荧光定量PCR检测结果显示miR-29b在H460细胞中的表达最高，在A549-L、A549、A549-H细胞中的表达依次降低，Western blot检测结果显示MMP2蛋白在A549-H细胞中的表达最高，在A549、A549-L、H460细胞中的表达依次降低，Spearman相关性分析显示miR-29b与MMP2蛋白在以上四种非小细胞肺癌细胞株中存在显著的负相关关系(r=-0.902，P<0.001)。 4、miR-29b上游转录因子的预测和鉴定 （1）通过Ensembl数据库在线获取编码miR-29b前体mir-29b-1序列所在基因的上游2kb作为mir-29b-1启动子序列。 （2）利用四个常用数据库Proscan、Consit、TFSEARCH及TRED预测及分析可能与mir-29b启动子结合的转录因子，综合四个软件的预测结果，挑选分值较高，且四个软件均有交集的转录因子 SRF作为miR-29b的转录因子。 （3）成功构建了过表达SRF的SRF-EGFP-N1载体和融合miR-29b启动子序列的miR-29b promoter-PGL3-Basic载体。荧光素酶报告检测系统结果显示：HEK293A细胞转染miR-29b promoter-PGL3-Basic后，荧光素酶活性较对照组明显增强(P=0.014)，说明 miR-29b启动子序列具有转录活性。共转染 miR-29b promoter-PGL3-Basic和SRF-pEGFP-N1后，荧光素酶活性较单转染 miR-29b promoter-PGL3-Basic组显著降低(P=0.024)，表明转录因子SRF能抑制 miR-29b启动子的转录活性。 （4）利用实时荧光定量PCR和Western blot检测转染过表达SRF质粒后，A549及 H460细胞中miR-29b和MMP2的表达，结果显示，两种细胞中SRF mRNA的表达显著升高(t=-4.326，P=0.012； t=-7.774，P=0.001)，证实转染成功。两种细胞中miR-29b的表达较对照组显著降低(t=13.492，P<0.001； t=3.790，P=0.019)，MMP2 mRNA的表达较对照组显著升高(t=-3.440，P=0.026； t=-5.931，P=0.004)，MMP2蛋白表达显著上调(t=-8.794，P=0.001； t=-10.502，P=0.001)，提示 SRF能抑制miR-29b的表达，促进MMP2蛋白的表达。 结论： 1、利用miRNA PCR芯片和肿瘤转移相关基因芯片相结合，综合生物信息学分析，成功筛选出非小细胞肺癌转移相关的miRNA——miR-29b，miR-29b在非小细胞肺癌组织和细胞株中表达下调，且其表达与非小细胞肺癌淋巴结转移呈负相关。 2、过表达miR-29b能抑制非小细胞肺癌细胞体内外的增殖、迁移及侵袭能力，而降低 miR-29b的表达能促进非小细胞肺癌细胞体内外的增殖、迁移及侵袭能力。提示miR-29b在非小细胞肺癌中扮演了抑癌基因的角色。 3、在非小细胞肺癌细胞中，MMP2是miR-29b的下游靶基因。 4、SRF是上游调控miR-29b表达的转录因子，SRF通过与miR-29b的启动子结合，抑制miR-29b的转录，进而增强了MMP2的表达，因此，SRF/miR-29b/MMP2通路极有可能是非小细胞肺癌转移的新机制。