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2015版《中国药典》中提到云芝Coriolus versicolor的功能及主治为健脾利湿,清热解毒,用于湿热黄疸,胁痛,纳差,倦怠乏力。国家二类新药云芝胞内糖肽,临床上主要用于保肝和癌症治疗且疗效显著。但由于云芝胞内糖肽的制备采用水提醇沉的传统方法,所得粗提物成分复杂,故云芝胞内糖肽目前存在活性成分不明确、结构特征不确定的问题。本文将针对云芝糖肽对新生血管作用的物质基础展开研究,为开发活性成分明确、治疗靶点清晰的云芝糖肽类药物做出努力。论文主要研究内容如下:1云芝菌种的分子生药学鉴定为保证药材生产、研究的科学性和用药安全,在菌株培养成功后采用分子生物学方法对菌株进行鉴定。培养得到S1090、S1037、S1340、CHANGBAISHAN和LIGONGDA五只菌株菌丝体后,采用ITS序列分析对其进行菌种鉴定,测序结果经BLAST比对后显示:五只菌株均属于核生物Eukaryota真菌界Fungi双核菌亚界Dikarya担子菌门Basidiomycota伞菌亚门Agaricomycotina伞菌纲Agaricomycetes多孔菌目Polyporales多孔菌科Polyporaceae栓菌属Trametes云芝versicolor菌种。系谱树结果显示:S1034和LIGONGDA菌株,S1090和CHANGBAISHAN菌株亲缘关系较近。2云芝发酵工艺的研究云芝大多采用液体深层发酵的方式获得,故需对优良菌株进行筛选并对其发酵工艺进行研究。本章以湿菌丝体得率、干菌丝体得率、糖肽得率为指标,最终筛选确定S1090菌株作为生产菌株。并对制备所得糖肽进行初步质量分析,结果表明:茚三酮颜色反应及α-萘酚颜色反应均呈阳性;总糖含量均高于35%;肽含量均高于25%;单糖含量均低于10%。各指标符合云芝胞内糖肽现有国家标准。进而进行工业发酵罐发酵研究。监测发酵过程,发酵进行72 h后,监测结果显示:菌浓、pH、总糖均下降;溶氧没有回升;镜检菌丝体粗壮;染色较浅。达到放罐要求,故进行放罐,得云芝发酵液。3云芝胞内糖肽的化学性质研究为明确活性成分提供基础,我们将对由S1090菌种经工业发酵罐发酵制备所得的云芝胞内糖肽进行化学成分分析。实验结果表明:茚三酮颜色反应和α-萘酚颜色反应均呈阳性;分子量分布的主峰保留时间为17.930 min,云芝胞内糖肽对照品主峰保留时间为17.842 min;总糖含量为43%;肽含量为42%;单糖含量为8.6%;水溶液吧值为4.81;云芝胞内糖肽水分含量为5.8%。4云芝糖肽化学成分的初步研究云芝发酵液仅有其菌丝体经水提醇沉后所得沉淀得以应用,其他部位均无进一步研究及开发,为提高云芝发酵液资源利用率,也为云芝类新药开发提供可能。发酵代谢产物分为胞内和胞外,分别经水提醇沉处理后得沉淀及上清液,干燥后得四种产物CPV-a(胞外上清液干燥物)、CPV-b(胞外沉淀物干燥物)、CPV-c(胞内上清液干燥物)、云芝胞内糖肽(胞内沉淀物干燥物)。对制备所得产物组成分析进行初步的探索。实验结果表明:CPV-a总糖含量51%,肽含量29%,单糖组成主要为葡萄糖和甘露糖,氨基酸组成主要为酪氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸和缬氨酸;CPV-b总糖含量35%,肽含量11%,单糖组成主要为葡萄糖和甘露糖,氨基酸组成主要为谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、半胖氨酸和缬氨酸;CPV-c总糖含量56%,肽含量20%,单糖组成主要为葡萄糖和甘露糖,氨基酸组成主要为苏氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸;云芝胞内糖肽总糖含量43%,肽含量42%,单糖组成主要为葡萄糖、甘露糖、半乳糖,氨基酸组成主要为天冬氨酸、苏氨酸和酪氨酸。5云芝胞内糖肽的结构特征分析对已成药的云芝胞内糖肽进行进一步精制纯化,分析其结构特征,为探讨物质基础提供参考。本章采用DEAE-52纤维素柱和CL-6B对云芝胞内糖肽进行纯化精制,最终精制得到五个纯度较高的云芝胞内糖肽组分CPV-1-1、CPV-1-2、CPV-2-1、CPV-2-2、CPV-2-3。对五个组分进行结构特征的分析。五个组分的分子量分别为22486 Da、16982 Da、8813 Da、5228 Da、6748 Da;紫外全波长扫描结果显示五个组分最大吸收波长在210 nm左右,280 nm左右有一肩峰;红外结果显示均有多糖特征吸收峰,且存在羧基质子化特征吸收峰;核磁结果由于分子量较大、水溶液粘度较大等问题,大多存在匀场,仅有CPV-1-2和CPV-2-3可进行简单特征解析,其中存在苯环、葡萄糖、吡喃糖、α-糖苷键的特征峰信息;五个组分单糖组成一致,均含有葡萄糖、甘露糖和半乳糖;建立云芝胞内糖肽TLC鉴别方法,正丁醇:丙酮:水=5:1:1进行展开,对氨基苯甲酸-冰醋酸-磷酸作为显色剂,日照及紫外灯365 nm下检视,该条件下单糖分离显著,鉴别结果与HPLC单糖分析结果一致;五个组分氨基酸组成基本一致,主要含:天冬氨酸、苏氨酸和酪氨酸。6云芝糖肽对新生血管作用的活性探究为明确云芝胞内糖肽活性成分和治疗靶点,所以需要对云芝糖肽对新生血管作用的活性展开研究。本章选用鸡胚尿囊膜实验模型,对由云芝发酵液制备所得的多种云芝糖肽、云芝胞内糖肽纯化组分进行活性对比和统计学分析,结合之前的成分及结构分析,对物质基础进行初步讨论。活性研究结果显示所有云芝糖肽对血管新生均具有抑制作用。云芝糖肽的活性结果显示:CPV-a、CPV-b、CPV-c和云芝胞内糖肽的抑制率分别为37%、30%、36%和28%,且统计学分析结果显示上清液产物与沉淀产物之间抑制作用存在显著性差异;云芝胞内糖肽自制品和云芝胞内糖肽上市品抑制率分别为28%、30%,统计学分析结果显示两者间不存在显著性差异:CPV-1-1、CPV-1-2、CPV-2-1、CPV-2-2、CPV-2-3五个云芝胞内糖肽纯化组分抑制率分别为:27.4%、26.2%、27.9%、29.8%、28.3%,统计学分析结果显示其五个组分间抑制作用均不存在显著性差异。