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酶联免疫分析技术作为简单、快速、灵敏及成本低廉的筛选检测方法，近年来在农药残留分析领域的应用越来越广泛。为了研究杂环类农药小分子化合物免疫化学的基本规律，本论文选择了杀虫剂中使用量较大的溴虫腈和氟虫腈，建立了其酶联免疫吸附测定方法。
本试验分别将溴虫腈吡咯环和氟虫腈毗唑环上的腈基还原成胺基后获得半抗原CFP—NH2和FIP—NH2，通过戊二醛(GA)形成的“Schiff base”共价连接，在载体蛋白与半抗原之间形成一个5C“桥”，得到偶联物CFP—NH2—BSA、CFP—NH2—OVA、FIP—NH2—BSA和FIP—NH2—OVA，经紫外光谱法鉴定偶联成功后，采用三硝基苯磺酸法(TNBS)测得以上四种偶联物偶联比分别为22：1、15：1、18：1和12：1。采用适当的佐剂将偶联物CFP—NH2—BSA和FIP—NH2—BSA乳化后，分别免疫Balb/c鼠后制备了二种相应的多克隆抗体，免疫期间采用间接竞争酶联免疫吸附法测定其抗血清效价，达标后进行全取血，采用辛酸—硫酸铵盐析法纯化抗血清并制成冻干粉，得到抗体Ab—CFP和Ab—FIP，其效价分别为4.78×104和3.26×104。
通过间接竞争酶联免疫分析(ELISA)法，对包被缓冲液、缓冲液pH值、离子强度、洗涤液量、反应时间、反应温度和有机溶剂等因素进行筛选，优化了ELISA方法的检测条件。结果表明，浓度为0.0500mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释包被原，二种包被原CFP—NH2—OVA和FIP—NH2—OVA在37℃下包被1.5h效果最佳。采用优化后的条件进行测定，其结果显示抗体Ab—CFP和Ab—FIP均表现出良好的亲和性和特异性。对于抗体Ab—CFP，当溴虫腈在0.0100～10μg/m浓度范围时，其抑制率有较好线性关系，线性回归方程为Y=30.9702ln(χ)+23.8535(r=0.9896)，最低检测限IC20值为0.0426μg/mL；对于抗体Ab—FIP，当氟虫腈在0.0500～10μg/mL浓度范围内，其抑制率有较好线性关系，回归方程为Y=31.3823ln(χ)+31.1145(r=0.9853)，最低检测限IC20值为0.0659μg/mL。
抗体Ab—CFP对与氟虫腈、毗虫啉、烟碱、克百威、氟乐灵和毒死蜱交叉反应率分别为1.7061％、2.1572％、1.1424％、2.2830％、0.7689％、0.9838％。抗体Ab—FIP对溴虫腈、毗虫啉、烟碱、克百威、氟乐灵和毒死蜱的交叉反应率分别为1.6217％、1.5194％、1.1157％、1.7596％、0.9815％和0.8591％。
用抗体Ab—CFP和Ab—FIP建立的ELISA分析方法，对水和甘蓝做添加回收试验，并与常规色谱分析法进行比较。以抗体Ab—CFP和相应的包被原建立间接竞争ELISA法测定水中溴虫腈的添加回收率为85.4316％～92.6372％，变异系数为5.0336％～6.3284％，甘蓝中添加回收率为84.3191％～88.2166％，变异系数为5.6418％—6.7617％；以抗体Ab—FIP和相应的包被原建立的间接竞争ELISA法测定在水中的添加回收率为83.3470％～92.5619％，变异系数为5.8537％～7.0128％，甘蓝上添加回收率为81.2441％～88.7243％，变异系数为6.6276％～7.3181％，符合农药残留检测要求。这与传统的色谱检测手段相比，在检测线性范围和灵敏度方面，两者差异不明显，但在样品前处理方面，则显示出ELISA快速、简单和有效的优点。
这二种农药的ELISA分析方法均满足其农药残留检测的要求，与传统的色谱检测手段相比，在检测线性范围和灵敏度方面，差异不明显，但在样品前处理方面，则显示出ELISA快速、简单和有效等优点。本研究为开发溴虫腈和氟虫腈的残留试剂盒奠定了基础。