论文部分内容阅读
目的:蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali, P.hepiali)是一种昆虫致病性真菌，它存在于冬虫夏草无性生长阶段并与其它菌株相互作用，合成冬虫夏草的多种药效成分，如嘌呤类核苷、虫草多糖、虫草酸等。利用蝙蝠蛾拟青霉的发酵生产药效成分是解决冬虫夏草供求矛盾的有效途径之一。目前对蝙蝠蛾拟青霉的研究主要集中在摸索适宜药效成分积累的发酵条件上，对其有效成分代谢的机制性研究仍较少。本论文利用新一代Solexa测序技术，从分子水平上获得大量的蝙蝠蛾拟青霉转录组数据，对其基因的功能进行初步的分析;同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)方法筛选与嘌呤类核苷代谢相关的关键酶基因，为后续的通过调节关键酶基因的表达调控蝙蝠蛾拟青霉的次生代谢提供理论基础。 方法:构建蝙蝠蛾拟青霉嘌呤类核苷代谢差异显著的两个样本，分别命名为Control（Con）与Sample(Sam);利用Trizol法抽提两个样本总RNA，寡聚(dT)纤维素柱层析法纯化mRNA后反转录成cDNA，Solexa双端测序获取转录组read片段，去除低质量的read，然后将剩余的高质量read序列利用AbySS软件进行拼接获得Unigene，通过BLASTx与Nr、SwissProt等数据库进行比对预测基因的功能，同时对有预测功能的基因进行GO、COG、KEGG聚类分析，构建蝙蝠蛾拟青霉的转录组数据库。利用RPKM值计算两个样本中基因的表达量，将表达差异倍数（Con/Sam）大于2或小于0.5，P值＜0.001的Unigene定义为差异表达显著的标签，并对差异表达显著的标签进行分析，预测嘌呤类核苷代谢关键酶基因。最后结合嘌呤类核苷代谢情况，利用qRT-PCR对关键酶基因进行表达验证。 结果和结论:在蝙蝠蛾拟青霉发酵进程的不同阶段，菌丝体生物量与嘌呤类核苷合成情况差异显著。接种前6天生物量稳定增加，但后期增长缓慢，在第11天生物量接近最大值，达到9.88g/L左右。单位菌丝体嘌呤类核苷含量随生物量的增加而逐渐降低，且前6天降速明显，后期速度逐渐减慢，至第11天时腺苷和鸟苷分别接近2.07mg/g，2.72mg/g的最低值，证明了在接种前期与后期，嘌呤类核苷代谢情况存在显著的差异。分别取培养第4天(Con)与第9天（Sam）的新鲜菌丝体，提取总RNA并纯化mRNA，反转录成cDNA后进行Solexa双端测序，去除低质量序列后Con组与Sam组分别获得71，009，301、76，440，650个read片段，糅合两个样本的read片段，利用AbySS软件进行拼接后，共获得23，850个contig，进一步利用pair-end序列拼接出17，685个Unigene，平均长度1，013bp，N50达到2，310bp。与Nr和SwissProt数据库进行BLASTx比对，共有10，690个Unigene得到注释，注释率达到61.6％;其中8，075条序列比对到蛹虫草（Cordyceps militaries）基因序列，比例达到75.6％。对有预测功能的序列进行GO富集分析，发现在生物过程(Biological Process)部分中，胞内进程与代谢进程富集序列最多，分别达到4，727条和3,951条，证明构建的转录组数据库中有相当大的部分与代谢有关;在细胞组成( CellularComponent)部分中，细胞成分和细胞器成分占据了绝大多数，大分子复合物也较多，达到1，218条，说明蝙蝠蛾拟青霉的代谢复杂;在分子功能(Molecular Function)部分中，具有催化活性的序列富集了3，161条，表明有相当大的部分为具有催化活性的酶基因。COG聚类分析的7，922条序列中，有5，969条具有明确的功能，其中与翻译后修饰、蛋白转运有关的最多，达到494条;其它涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂代谢及次生代谢的总计1，426条。在KEGG代谢通路分析中，共有2，597个基因比对到284个代谢途径中，其中与核苷酸代谢有关的基因有128条，与嘌呤核苷酸代谢相关的基因有79条。利用RPKM值计算Con与Sam样本中基因各自的表达量，在Con中特异表达的基因有1，033条，Sam中有337条;利用R软件包(DEG-seq)共鉴别出1，756条表达差异显著的酶基因。在嘌呤类核苷代谢途径中，PRPP合成酶、PRPP转酰胺酶、腺苷琥珀酸合成酶、IMP脱氢酶与GMP合成酶受产物的反馈抑制，这些酶基因的表达在Con中被高含量的腺苷和鸟苷抑制，但在Sam中的抑制作用被减弱，相应的酶基因在两个样本中的表达量通过qRT-PCR实验得到了验证，由此证明这五个基因都是蝙蝠蛾拟青霉嘌呤类核苷代谢途径中的关键调控基因。