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手性环氧化物是有机合成中的重要中间体,广泛应用于医药、农药和精细化工品的合成。例如手性苯基缩水甘油醚（phenyl glycidyl ether,PGE）是神经保护分子和β-阻断剂的重要中间合成体。化学法制备手性环氧化物存在环境不友好、反应条件苛刻、选择性低等问题。生物法能有效解决上述问题。环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs）能选择性催化外消旋环氧化物动力学拆分获得手性环氧化物。来源于Sphingomonas sp.HXN-200的EHs（SpEH）具有宽底物谱、高底物浓度耐受性、高活性和高选择性的优点,能催化外消旋PGE水解以制备（R）-PGE,但其对映选择性（E值）偏低,且在水相中催化高浓度PGE水解时存在明显的抑制现象。针对以上问题,本文利用基因工程手段将SpEH基因在大肠杆菌中进行克隆表达,优化其诱导条件;利用定点和组合突变对SpEH进行分子改造以提高其对映选择性,分离纯化最优突变体酶,研究其酶学性质;引入双相体系并对各关键因素进行优化,提高底物浓度和生产效率,建立高效、高选择性制备（R）-PGE的生物催化体系。SpEH基因在E.coli BL21（DE3）中高效表达,重组SpEH的实际分子量为45 k Da,约占E.coli总蛋白的28.8%。最佳诱导条件为:培养基初始p H为7.0,诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度为0.05 m M,诱导温度为25°C,诱导时间为8 h,在此条件下重组菌的产酶活力为1.96 U/mg dcw。重组SpEH对（R）-PGE和（S）-PGE区域选择性系数βR和βS分别为99.3%和98.7%,表明其专一性攻击Cβ。E.coli＿SpEH在25°C和p H7.0条件下催化rac-PGE动力学拆分的E值为7.7。基于计算机辅助计算,对活性口袋附近的6个氨基酸进行定点和组合突变,得到最优突变体SpEHV196A/N226A/M332A,其催化PGE水解反应的E值和酶活为21.2和200 U/mg,是野生型的2.8和2.3倍。酶学性质研究表明:SpEHV196A/N226A/M332A的最适反应温度和p H分别为25°C和7.0,在低温和偏碱性条件下具有较高活性和稳定性;Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+和SDS严重抑制其酶活;SpEHV196A/N226A/M332对（R）-PGE的Km和kcat分别为14.7 m M和95.4 s-1,对（S）-PGE的Km和kcat值分别2.6 m M和275.3 s-1,专一性常数比值(kScat/KmS)/(kRcat/KmR)为16.2,表明其优先水解（S）-PGE。E.coli＿SpEHV196A/N226A/M332A催化20 m M rac-PGE水解反应的最适温度、缓冲液p H值和底物浓度分别为25°C、7.0和20 m M,在上述条件下,（R）-PGE的产率和ees值分别为44.1%和82.5%,反应的E值为19.6。产物抑制是限制E.coli＿SpEHV196A/N226A/M332A催化水解高浓度底物的主要因素,乙酸丁酯/缓冲液双相体系能缓解产物抑制。E.coli＿SpEHV196A/N226A/M332A在乙酸丁酯/缓冲液双相体系催化rac-PGE水解反应的最佳工艺条件为:两相体积比为7:3（v/v）,缓冲液p H为7.0,反应温度为25oC,S/E比值为9（w/w）,额外添加5%的吐温-60（w/w）,底物浓度提高至300 m M。与优化前相比,（R）-PGE的ees从96.1%提高至99.2%,产率从30.3%提高至31.6%,STY从9.64 g/L/h提高到18.93 g/L/h,a TOF从2.68 g/h/g提高至3.79 g/h/g。本研究利用半理性设计对SpEH进行分子改造,提高了其酶活和对映选择性,为其它酶的分子改造提供实践经验;同时建立了一种高效制备（R）-PGE的生物催化体系,为高效、高选择性制备手性环氧化物建立了基础。