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慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)不可逆转的最终结局是终末期肾功能衰竭,肾小管间质纤维化(tubular interstitial fibrosis, TIF)是这一过程的共同病理途径。肾小管上皮-间充质转分化在肾脏纤维化过程中具有重要作用。EMT的完成需要数天时间,经过一系列复杂的步骤,包括早期细胞间接触的丧失、上皮标记物ZO-1和E-cadherin的下调、细胞骨架重建、上皮细胞形态改变、梭形形态的获得、以及最终间充质标记物a-SMA、vimentin的表达等。E-cadherin/β-catenin粘附复合体在上皮细胞-细胞间粘附的形成和维持分化成熟的上皮细胞表型中具有关键作用。E-cadherin/β-catenin粘附复合体的失调是转分化过程的重要步骤。TGF-β1是诱导EMT发生的重要细胞因子,研究发现其信号传导需要多种介质的参与,包括Smad(5)、PI3K-Akt、ILK、Rho-A、MAPK、ERK、p38 MAPK和JNK等。蛋白激酶D (protein kinase D, PKD)家族在多种细胞的生物功能(包括信号传导、膜转运、蛋白转运、细胞存活、迁移、分化和增殖等)中发挥重要作用。新近发现的PKD与TGF-β1信号传导有关。PKD参与细胞粘附和迁移的调节,在细胞骨架重塑和细胞形态调控中具有重要作用。本课题探讨了PKD1在TGF-β1诱导小管EMT中的作用；通过构建野生型、Y654E、Y654F突变型β2-catenin表达载体和建立其稳定表达的HKC细胞株,进一步研究了TGF-β1作用下,PKD1—ERK1/2信号通路在调控E-cadherin/β-catenin粘附复合体稳定性中的作用。第一部分连环素-β野生型及其Y654酪氨酸磷酸化突变体的真核载体构建及表达目的构建β-catenin及其Y654突变体融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,转染肾小管上皮细胞(HKC)并建立其超量表达的HKC细胞系,为进一步研究β-catenin在肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)过程中的作用提供基础。方法用亚克隆方法将野生型β-catenin基因插入真核表达载体pEGFP-C1,用定点突变方法将重组质粒pEGFP-C1/β-catenin定点突变为Y654F、Y654E两型,将pEGFP-C1-β-catenin WT、Y654F、Y654E分别转染肾小管上皮细胞(HKC)并利用G418抗性筛选其稳定表达的HKC细胞克隆,扩增建系。结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin WT、Y654F、Y654E蛋白的重组质粒构建成功,RT-PCR、免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin WT、Y654F、Y654E-GFP融合蛋白在真核细胞中获得表达。结论成功构建β-catenin及其Y654突变体融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,并获得其在人肾小管上皮细胞中超量表达的细胞系。第二部分蛋白激酶D1参与转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化机制的初步研究目的通过建立TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)模型,采用免疫印迹、免疫荧光共聚焦检测和PKD1-siRNA等方法,研究PKD1在肾脏纤维化中的作用。方法(1)分别用10.0ng/ml TGF-β1、10.0ng/mlEGF和联合运用10.0ng/ml TGF-β1+10.0ng/mlEGF刺激正常正常人肾小管上皮细胞(HKC),观察细胞形态变化,用免疫印迹法检测E-cadherin、Vimentin、PKD1、磷酸化PKDl的表达水平,免疫荧光观察E-cadherin、Vimentin定位。(2)用siPKD1转染细胞,观察各组细胞中E-cadherin、Vimentin表达的变化及细胞形态变化。结果(1)用10.0ng/ml TGF-β1刺激HKC后,细胞类圆形逐渐变为长梭形,且伴有E-cadherin表达明显减少和Vimentin表达显著增高,磷酸化PKD1水平逐渐增高；10.0ng/mlEGF不足以引起HKC细胞的上述改变；10.0ng/ml TGF-β1+10.0ng/mlEGF则使上述改变更为明显。(2)转染siPKD1后,上述改变受到明显抑制。结论EGF与TGF-β1在诱导HKC细胞转分化过程中具有协同作用, EGF可以促进TGF-β1诱导的PKD1活化。第三部分蛋白激酶D1参与调控转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化中E-cadherin/β-catenin复合体的活性目的通过建立体外TGF-β1诱导人肾小管转分化EMT模型,采用免疫印迹、免疫荧光共聚焦检测和PKD1-siRNA等方法,研究PKD1参与调控E-cadherin/β-catenin活性在肾小管EMT中的作用。方法(1)用10.0ng/ml TGF-β1刺激HKC细胞,用免疫印迹法检测PKD1、磷酸化PKD1、ERK1/2、磷酸化ERK1/2、E-cadherin、β-catenin和PY20的表达水平。(2)分别用si-PKD1和PD98059干预细胞,检测TGF-β1作用下上述指标的表达变化。用免疫荧光共聚焦观察E-cadherin、β-catenin的定位。(3)分别用siPKD1和PD98059干预表达野生型β-catenin的HKC细胞,观察β-catenin的定位和表达。结果(1)用10.0ng/ml浓度的TGF-β1刺激HKC后,磷酸化PKD1、磷酸化ERK1/2随时间延长表达水平逐渐增高,磷酸化ERK1/2的升高出现时间晚于磷酸化PKD1；β-catenin总水平无明显变化而酪氨酸磷酸化水平升高。(2) si-PKD1和PD98059干预细胞后,TGF-beta1作用下小管细胞未发生明显形态变化,且E-cadherin、β-catenin表达无明显变化。si-PKD1组中ERK1/2的磷酸化水平受明显抑制。(3) siPKD1和PD98059干预表达野生型β-catenin的HKC细胞后,TGF-β1诱导的β-catenin核移位收到抑制。结论TGF-β1诱导的PKD1-ERK1/2信号途径活化,对E-cadherin/β-catenin粘附复合体的形成具有调控作用。